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摘要口腔癌是全球第六种最常见的癌症类型，在侵略性病例中，口腔鳞状细胞癌约占90%。即使现代医学策略在预防和治疗方面取得了很好的进展，在过去的几十年里，由于延迟诊断，患者错过了最佳的专业治疗时机，导致口腔癌的总体5年生存率并没有得到明显改善。提高口腔癌早期诊断的准确率可以成为提高生存率、降低高死亡率和医疗经济负担的有效手段。目前，检测口腔癌前病变和癌症的最常见程序包括视诊和触诊，而后通过组织活检进行确诊。<br>　　最近，生物标志物被广泛应用于癌症的检测。癌胚抗原（CEA）作为一种存在于血清中的广谱癌症生物标志物，其浓度与口腔癌的发生、发展程度呈正相关。然而，通过检测血清中的 CEA 来辅助诊断口腔癌的手段在检测灵敏度和准确性方面还有待解决。血液中存在的众多干扰物质会阻碍CEA分子的精确检测。除此之外，血清中CEA的高含量也可作为其他类型肿瘤的相关标志物。因此，血清中CEA的测定将不能明确和准确地支持口腔癌的诊断。与血液相比，唾液由于其无痛无创采样的优势，更适用于护理点测试（POCT）。与传统诊断工具相比，唾液检测减少了时间、资源的成本，极有可能取代传统血液诊断的地位。更重要的是，就口腔癌的临床情况而言，由于肿瘤位置离口腔很近，肿瘤标志物除了进入血液和淋巴循环系统外，也更容易直接进入唾液中。因此，快速和连续监测唾液中的肿瘤标志物（如CEA）水平，将使口腔癌诊断方面取得重要突破。在众多检测生物标志物的方法中，基于上转换荧光的光学传感技术以低毒性、对生物样品的损伤小、背景噪音低等优势被广泛应用。而光子晶体为上转换荧光检测提供了显著的优势，两者结合构建的芯片式传感平台操作简便、十分便携，将大大推进口腔癌诊断的发展。<br>　　实验目的：<br>　　设计并制备一种将上转换纳米粒子（UCNPs）与光子晶体（OPC）相结合的免疫荧光传感器，通过测定形成免疫夹心结构后传感系统的荧光猝灭强度，从而检测唾液中的CEA浓度。<br>　　实验方法：<br>　　1. 采用油热法合成 NaYF4:Yb3+, Er3+上转换纳米粒子，并利用合适浓度的盐酸将油热合成法在UCNPs表面形成的油酸（OA）配体洗掉，替换成亲水的PEI配体。<br>　　2. 通过透射电子显微镜（TEM），傅里叶红外光谱（FTIR），荧光光谱等手段对UCNPs进行表征测定。<br>　　3. 通过水热法合成980 nm的PMMA微球，对形成的PMMA薄膜进行防水处理。在OPC薄膜上生长一层PDA膜后将UCNPs修饰在OPC薄膜上。<br>　　4. 通过扫描电子显微镜（SEM），傅里叶红外光谱（FTIR），透射光谱，元素维度分布谱技术（Element Mapping）对OPC/UCNPs薄膜进行表征测定。对OPC/UCNPs薄膜和单纯修饰了UCNPs的玻璃基片进行荧光强度的对比，以验证OPC对上转换荧光的放大效果。<br>　　5. 分别对OPC/UCNPs薄膜进行水稳定性测试、酸碱稳定性测试及存储稳定性测试，以验证该传感薄膜符合POCT的要求。对修饰了捕获CEA抗体的OPC/UCNPs薄膜进行了抗干扰性测试，证明该薄膜对CEA的检测具有高度特异性。<br>　　6. 在PBS缓冲液中加入不同浓度梯度的CEA，对合成的传感器的灵敏度进行测试。在人工唾液中加入同样浓度梯度的CEA，验证该传感器对唾液检测的灵敏度。收集了健康人及口腔癌患者的唾液，验证该传感器在实际样本检测中的应用可行性。<br>　　实验结果：<br>　　1. 油热法成功合成了NaYF4:Yb3+, Er3+，置换了配体的PEI-UCNPs在水中的分散性更好。置换了PEI配体后UCNPs自身的荧光强度仍能满足检验的需求。<br>　　2. 成功制备了带隙在980nm处的PMMA微球。对PMMA薄膜进行防水处理后在其表面生长了一层致密的PDA膜。PEI-UCNPs通过化学键在PDA膜上连接一层。<br>　　3. 处理后的 OPC/UCNPs 薄膜将 NaYF4:Yb3+, Er3+自身的上转换荧光增强了约66倍。同时该荧光薄膜通过了各种稳定性测试，具有良好的水稳定性、酸碱稳定性、存储稳定性，且对目标待测物具有极强的特异性。<br>　　4. 该传感器对溶解在PBS缓冲液中的不同浓度梯度的CEA具有较为敏感的响应，荧光猝灭的强度随着CEA浓度的升高而增加，且分别在0.1-2.5 ng mL-1及大于2.5 ng mL-1的范围内呈线性趋势，检测限低至0.1 ng mL-1。该传感器对于溶解在人工唾液中的CEA也具有同样趋势的响应。<br>　　5. 使用该传感器对采集的实际临床样本进行测试。测试结果能够明显区分健康人和口腔癌患者。<br>　　实验结论：<br>　　该工作中设计开发的基于上转换荧光共振能量转移的 CEA 生物传感器，针对上转换荧光效率低的问题，采用OPC结构作为检测基地，增强了UCNPs的荧光强度。通过优化OPC/UCNPs薄膜的形成，将上转换荧光增强了66倍，对待测物质表现出更高的检测灵敏性。该生物传感器在0.1-2.5 ng mL-1和2.5-20 ng mL-1的范围内分别显示出良好的线性，检测限为0.1 ng mL-1，足够实现检测唾液中CEA的目标。整个检测过程可在90分钟内完成，操作简便，对口腔癌的诊断有非常有利的意义。