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摘要研究目的：<br>　　我课题组自行设计出靶向NF-κBp65mRNA的反义寡核苷酸，在体外牙髓炎模型筛选后，在大鼠早期牙髓炎模型观察其对NF-κB表达的影响以及对早期牙髓炎的治疗作用，为临床抑制炎症、保存活髓提供了新的思路。<br>　　研究方法：<br>　　1.靶向NF-κBp65mRNA反义寡核苷酸的设计：首先，我们利用美国国家生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）数据库，分别获得人和大鼠的NF-κBp65mRNA序列。接着，利用NCBI的基础局部排序检索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST）对比分析，筛选出长度≥25bp的同源序列作为靶区域。在primer软件中，获得了与靶区域互补的候选反义寡核苷酸（Antisenseoligonucleotides，ASOs）。然后，利用Sfold和RNAfoldwebserver在线分析软件评估了所有候选ASOs与靶区域结合的可能性。最后，利用NucleotideBLAST网络数据库对评选出的靶向人和大鼠NF-κBp65mRNA同源序列的ASOs（antisenseoligonucleotidestargetingNF-κBp65mRNA，PMOs）进行了特异性分析。<br>　　2.PMOs的体外筛选：我们利用酶消化法和组织块法提取了人牙髓细胞（humandentalpulpcells，hDPCs）和大鼠牙髓细胞（ratdentalpulpcells，rDPCs），通过光学显微镜观察和免疫荧光实验完成DPCs的鉴定。接着，将带有Cy3+荧光标记的PMOs与DPCs共培养，使用激光共聚焦显微镜观察PMOs与DPCs的位置关系。然后，用1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)分别刺激人牙髓细胞（hDPCs）和大鼠牙髓细胞（rDPCs），通过RT-qPCR法确定抑制NF-κB表达的最佳时间点，建立牙髓炎的细胞模型。将实验组分为对照组、LPS组、LPS+PMO1组、LPS+PMO2组、LPS+PMO3组，利用RT-qPCR法和WB法检测PMO1、PMO2和PMO3对NF-κB基因表达的影响。筛选出效果最佳的PMO进行下一步体内研究。<br>　　3.PMO3对早期牙髓炎的治疗作用：将8周龄，体重220g±20g的Wistar雄性大鼠18只，随机分为3个实验组，每组6只。对照组：大鼠不做处理。LPS组：大鼠上颌左右第一磨牙??面中央开髓，将吸附5μlLPS(10μg/ml)的明胶海绵置于开髓孔处，玻璃离子暂封窝洞。LPS+PMO3组：在大鼠上颌左右第一磨牙??面中央开髓，将吸附5μlLPS(10μg/ml)+PMO3(10μg/ml)的明胶海绵置于开髓孔处，玻璃离子暂封窝洞。24h后处死大鼠取材。HE染色观察大鼠牙髓组织病理形态表现：牙髓组织炎症范围和浸润炎症细胞的数量。IHC染色和WB法检测大鼠牙髓组织中NF-κBp65、p-p65以及下游炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达水平。RT-qPCR法检测各组牙髓组织中NF-κBp65及其下游炎症因子IL-1β和TNF-αmRNA表达水平。将大鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行HE染色观察：分析PMO3是否有药物毒性作用。<br>　　研究结果：<br>　　1.利用NCBI网络数据库，获得人和大鼠的NF-κBp65mRNA序列，编号分别为NM_001145138.2和NM_199267.2。然后，利用BLAST网站筛选出人和大鼠NF-κBp65mRNA同源序列中长度≥25bp的12段保守序列。在primer软件中，针对上述12段保守序列设计出了138个与靶区域互补的候选ASOs。接着，利用Sfold和RNAfoldwebserver在线分析软件评估了所有候选ASOs与靶区域结合的可能性，筛选出第29、30、72号候选ASOs。最后，经NucleotideBLAST网络数据库对比分析，所评选出的三个候选ASOs均具有特异性，分别将其命名为PMO1、PMO2和PMO3进行后续实验。<br>　　2.光学显微镜观察显示：hDPCs和rDPCs均成梭形或者扁星形，但rDPCs较hDPCs短小。两种细胞生长均有一定方向，覆盖瓶底后呈栅栏状排列，无多层生长，存在接触抑制现象。免疫荧光染色显示：细胞波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。RT-qPCR结果显示：在hDPCs中，LPS（1μg/ml）刺激10h时细胞中NF-κBp65mRNA表达量最高；在rDPCs中，LPS（1μg/ml）刺激8h时细胞中NF-κBp65mRNA表达量最高。免疫荧光实验显示：PMO1、PMO2、PMO3均能进入hDPCs和rDPCs内部。RT-qPCR结果表明：与对照组相比，在LPS组中NF-κBp65、IL-1β和TNF-α的mRNA表达均升高。然而，LPS+PMO组中NF-κBp65的mRNA表达水平均降低，下游炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平降低更为明显。WB实验结果表明：与对照组相比，LPS组中NF-κBp65、p-p65、IL-1β和TNF-α的蛋白表达均升高。然而，LPS+PMO组中NF-κBp65、p-p65的蛋白表达水平均降低，下游炎症因子IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平也明显降低。三个PMOs中以PMO3的体外抗炎效果最佳，进一步用于体内牙髓炎模型的研究。<br>　　3.大鼠牙髓组织HE染色结果显示：与对照组相比，LPS组牙髓炎症集中在冠髓，有大量的炎症细胞的浸润。与LPS组相比，LPS+PMO3组炎症范围缩小，炎症细胞的浸润减少。体内IHC染色和WB实验结果显示：与对照组相比，LPS组牙髓组织中的NF-κBp65、p-p65的蛋白表达水平均升高，其下游的炎症因子IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平升高更明显。而与LPS组相比，LPS+PMO3组牙髓组织中的NF-κBp65、p-p65的蛋白表达水平均降低，其下游的炎症因子IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平降低更明显。大鼠牙髓组织RT-qPCR结果显示：与对照组相比，LPS组牙髓组织中的NF-κBp65的mRNA表达水平升高，其下游的炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平升高更明显。而与LPS组相比，LPS+PMO3组牙髓组织中的NF-κBp65的mRNA表达水平降低，其下游的炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平降低更明显。大鼠重要脏器的HE染色结果显示：与对照组比较，LPS+PMO3组大鼠各脏器的细胞形态无异常。<br>　　研究结论：<br>　　1.完成了靶向NF-κBp65mRNA反义寡核苷酸的设计与合成。<br>　　2.成功建立了牙髓炎细胞模型和动物模型。<br>　　3.PMOs均能进入牙髓细胞内，并成功抑制牙髓炎模型中NF-κBp65及其下游炎症因子的表达。<br>　　4.PMO3能治疗LPS引起的牙髓炎症，且具有生物安全性。