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摘要尼帕病毒性脑炎是由尼帕病毒（Nipha virus，NiV）引起的人兽共患传染病。该病于 1998年首次在马来西亚暴发，近些年已蔓延到马来西亚、孟加拉国、菲律宾、新加坡和印度等亚热带地区。NiV通过果蝠-猪-人传播链传播。人感染后表现为发热、头痛、呕吐、脑炎和呼吸系统疾患，病死率为 40%~80%。猪感染后出现神经系统和呼吸系统症状，也可导致流产和死亡。由于尼帕病毒性脑炎具有较高的致死性和毁灭性，WHO将其列入优先研究疾病蓝图清单[1]。2022年6 月，我国农业农村部下发的公告中将其列为一类动物疫病。国家过敏和传染病研究所和美国疾病控制和预防中心（centers for disease control and prevention， CDC）将 NiV 列为生物防御关注的病原体，美国 CDC 还按照危险程度将其归为C类生物武器。<br>　　为了降低尼帕病毒性脑炎传入我国的风险，并为我国的尼帕病毒性脑炎防控提供技术支撑和物资储备，本研究以狂犬病病毒（rabies virus，RABV）和革兰氏阳性增强基质为载体，分别构建了表面展示NiV主要保护性抗原F或G蛋白的重组 RABV疫苗和细菌样颗粒（bacteria-like particle，BLP）疫苗，并对两类候选疫苗的免疫原性进行了评价。<br>　　主要开展了以下研究：<br>　　1、重组NiV-F/G基因的RABV的构建与鉴定<br>　　以 RABV/SRV9株为反向遗传载体，分别拯救出表面嵌合有 NiV纤突糖蛋白F或G的两株重组病毒。将NiV的F或G基因分别插入RABV载体P和M基因之间，构建 RABV感染性克隆，然后将其分别与四个辅助质粒 pcDNA3.1-SRV9-N、pcDNA3.1-SRV9-P、pcDNA3.1-SRV9-L和 pcDNA3.1-SRV9-G共转染BSR细胞，拯救获得rSRV9-NiV-F和rSRV9-NiV-G两株重组病毒。Western blot鉴定结果显示，纯化后的两株重组病毒可以表达NiV的F或G蛋白；在免疫透射电镜下观察到，两株重组病毒表面分别被特异性驴抗鼠和驴抗兔金标抗体识别并标记。由此表明，在RABV/SRV9表面分别嵌合了NiV的F或G糖蛋白。由病毒的生长动力学曲线可以看出，两株重组病毒与载体病毒的增殖能力无显著差异；在连续 10次传代后，NiV的 F或 G基因的 PCR鉴定结果仍为阳性，表明所构建的两株重组病毒可以在BSR细胞中稳定传代。<br>　　2、展示NiV-F/G蛋白的细菌样颗粒的构建与鉴定<br>　　利用 GEM-PA 系统构建了两种展示 NiV-Fetc和 NiV-Getc蛋白的细菌样颗粒。杆状病毒-昆虫细胞表达系统分别表达包括 NiV的 F或 G蛋白胞外域和锚钩蛋白 PA 的融合蛋白，将两种融合蛋白分别与 GEM 结合，获得 BLP-NiV-Fetc和BLP-NiV-Getc两种细菌样颗粒。Western blot 和间接免疫荧光试验结果显示，两种融合蛋白均可在 Sf9 细胞内表达；在免疫透射电镜下观察到，特异性驴抗鼠金标抗体能够有效识别并结合在 BLP-NiV-Fetc和 BLP-NiV-Getc表面。由此表明，在BLP表面分别展示了NiV的F或G糖蛋白。<br>　　3、重组NiV-F/G基因的RABV的免疫原性研究<br>　　利用灭活的重组病毒免疫小鼠，检测其细胞免疫和体液免疫水平。将重组病毒 rSRV9-NiV-F 和 rSRV9-NiV-G 经 β-丙内酯灭活后，灭活的病毒加入 ISA 201 VG和poly(I:C)复合佐剂免疫4~6周龄SPF级BALB/c小鼠，检测其免疫应答参数。结果显示，免疫后小鼠体重与对照组比无明显变化。第三次免疫后分离的小鼠脾淋巴细胞，经 NiV 糖蛋白刺激后，免疫组脾细胞增殖能力极显著高于对照组（plt;0.001），脾淋巴细胞分泌的 IFN-γ 和 IL-4 因子都显著高于对照组（plt;0.01~0.001）。利用商品化 ELISA 细胞因子检测试剂盒检测 Th1 型（IFN-γ、TNF-α和IL-2）和Th2型（IL-4、IL-6和IL-10）细胞因子，检测结果显示，与对照组比均有不同程度的提高。两株重组病毒均还可以刺激小鼠产生特异性IgG。第三次免疫后重组病毒 rSRV9-NiV-F、rSRV9-NiV-G 和联合免疫组的特异性抗体滴度分别可达1∶106,496、1∶155,648和1∶40,960。抗体亚类鉴定结果显示，三个免疫组诱导产生的 IgG2a/IgG1均大于 1，说明免疫反应以 Th1型免疫应答为主。重组病毒免疫血清的反应原性 IEM 鉴定结果表明其具有较好的反应原性，可以与BLP抗原发生特异性的结合。<br>　　4、展示NiV-F/G蛋白的细菌样颗粒的免疫原性研究<br>　　利用细菌样颗粒免疫小鼠，检测其细胞免疫和体液免疫水平。将制备的BLP-NiV-Fetc和BLP-NiV-Getc分别加入 ISA 201 VG和 poly(I:C)复合佐剂，免疫4~6周龄 SPF级 BALB/c小鼠，检测其免疫应答参数。结果显示，BLPs免疫后，与对照组相比，未对小鼠体重产生明显影响。在第三次免疫后分离小鼠脾淋巴细胞，检测其增殖能力和细胞因子分泌水平，由结果可以看出，经 NiV的 F或G 蛋白刺激后，加入 CCK-8 刺激脾细胞增殖，刺激指数均极显著高于对照组（ plt;0.001 ）。分泌 IFN-γ、IL-4 因子的脾淋巴细胞数也显著多于对照组（plt;0.05~0.001）。脾淋巴细胞分泌到上清中的细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6 和 IL-10）也有不同程度的增加。BLPs 免疫小鼠后均可刺激小鼠产生特异性 IgG。在第三次免疫后，BLP-NiV-Fetc、BLP-NiV-Getc和联合免疫组抗体滴度分别可达 1∶8,192、1∶16,384 和 1∶45,056。抗体亚类鉴定结果显示，三个免疫组第三次免疫后诱导产生的 IgG2a/IgG1 均小于 1，说明免疫反应以倾向于Th2型免疫应答为主。<br>　　综上，本研究成功制备了表达NiV-F或G蛋白的重组RABV载体灭活疫苗和细菌样颗粒疫苗。两种候选疫苗均具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。rSRV9-NiV-G 三次免疫后特异性 IgG 滴度可达 1∶155,648；BLP-NiV-Fetc和 BLP-NiV-Getc联合免疫三次后特异性 IgG 滴度达 1∶45,056。本研究为研制免疫原性强、安全有效的尼帕病毒性脑炎新型疫苗奠定了基础，也为我国的尼帕病毒性脑炎的防控提供技术支撑和物资储备。