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摘要原发性小头畸形（PMCPH）是一种常染色体隐性遗传病，发病特点是大脑小但结构正常，有轻度至中度智力障碍。PMCPH在欧美人群中的发病率较高，在我国时有发生，但并未引起足够的重视。YIPF5 又称 YIP1A，是五次跨膜蛋白Yip1p/Yif1p家族成员，目前对该基因的研究内容包括该基因表达、亚细胞定位以及参与内质网和高尔基体间的运输等方面，但 YIPF5 在神经系统方面的研究却处于空白状态。最近报道称YIPF5 p.（Trp218Arg）纯合突变病人存在严重的小头畸形并伴有明显的发育迟缓。目前，没有模拟YIPF5突变的PMCPH动物模型，该基因突变导致PMCPH的发病机制尚不清楚。因此，构建YIPF5突变的PMCPH动物模型，并通过此模型深入探究其致病机制具有重大的意义。<br>　　在本研究中，利用高效的无 PAM 限制的腺嘌呤碱基编辑系统（ SpRY-ABEmax）分别对家兔和脑神经瘤细胞（N2A）的YIPF5基因218位点进行突变，并对YIPF5基因突变的致病机理进行深入研究。主要研究内容和结果如下：<br>　　首先，通过SpRY-ABEmax系统，构建了YIPF5 p.W218R突变的N2A单克隆细胞，并成功获得了纯合（YIPF5R/R）和杂合（YIPF5W/R）两种细胞系。通过透射电镜（TEM）观察，两种细胞系均出现了内质网应激（ERs），且YIPF5R/R细胞系ERs更加显著。同时对未折叠蛋白反应（UPR）通路蛋白水平进行检测，发现两种细胞系均发生 ATF6通路的激活。进而对 UPR 通路下游的自噬和凋亡通路进行蛋白水平的检测，结果显示突变细胞系的凋亡蛋白的表达显著升高，自噬蛋白的表达显著降低。此外，本研究还对突变细胞系的增殖能力进行了检测，通过MTT及CCK8法检测细胞增殖能力，结果表明YIPF5R/R和YIPF5W/R细胞系细胞增殖能力均被抑制，且YIPF5R/R细胞系细胞增殖能力下降更显著。以上结果表明，YIPF5 p.W218R突变细胞系存在ERs并激活UPR，同时抑制自噬，增加细胞凋亡，减少细胞增殖。<br>　　其次，本研究利用SpRY-ABEmax系统成功构建了YIPF5 p.W218R纯合突变（YIPF5R218R）的家兔模型。通过对模型兔的体重、头围、身长及死亡率的持续监测发现，纯合突变兔从一日龄开始出现头围偏小、发育迟缓和死亡率升高等病症。随后对YIPF5R218R纯合兔的行为学进行观察，结果发现YIPF5R218R纯合兔奔跑时出现后肢震颤和单肢不自主抽动的异常情况。接下来对模型兔进行影像学监测，X光显示2月龄（2 M）纯合兔模型头部额枕骨距离明显小于WT。YIPF5R218R纯合兔腓肠肌的肌电图（EMG）显示，YIPF5R218R纯合兔出现异常的插入电位和静息电位。此外，认知行为学实验Y迷宫显示，纯合兔模型存在认知障碍。上述结果表明，本研究构建的 YIPF5 p.W218R 突变纯合家兔模型能够模拟人类病例的表型，包括小头畸形、发育迟缓、智力和运动障碍等。<br>　　最后，本实验研究了 YIPF5R218R 纯合兔的致病机理。通过 TEM 观察， YIPF5R218R纯合兔模型出现了严重的ERs并且激活了ATF6通路。进而对UPR通路下游的自噬和凋亡通路进行蛋白水平的检测，结果显示纯合兔模型的凋亡蛋白的表达显著升高，自噬蛋白的表达显著降低。此外，本实验研究了大脑皮质发育过程中神经祖细胞标志物的mRNA和蛋白水平，结果显示YIPF5R218R纯合兔的顶端祖细胞（APs）的数量较少，进一步免疫荧光结果显示APs的增殖受到抑制。以上研究结果表明，YIPF5 p.W218R突变兔模型的脑皮质存在ERs并激活UPR通路，而且突变抑制自噬，增加细胞凋亡，并引起APs增殖受阻，最终导致神经发育障碍即小头畸形的发生。<br>　　综上所述，本研究首次利用SpRY-ABEmax系统成功构建YIPF5 p.W218R突变介导的PMCPH家兔模型且该模型具有人类临床典型病理特征。同时机制研究表明 YIPF5 p.W218R 纯合突变可造成大脑皮层内质网应激导致的祖细胞凋亡和增殖率下降，从而进一步影响大脑发育。该研究发现对于PMCPH的辅助治疗提供重要的理论依据。