检索历史 清除

摘要随着世界人口老龄化增加，老年性骨质疏松症（senile osteoporosis，SOP）已成为最常见的骨骼疾病，其特征是骨量降低，骨组织微结构退化，增加了骨脆性和骨折的风险，严重影响人类健康。SOP 扰乱破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成的协调作用，破骨细胞活性增强成骨细胞活性降低，骨吸收速度大于骨形成，导致骨结构的丧失。胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor-1, IGF-1）通过对成骨细胞活性的直接或间接作用在 SOP 中发挥重要作用。本课题组前期发现物种间高度保守的IGF-1基因编码区中存在且仅存在一个同义突变 c.258G＞A（rs322131043），并发现该同义突变改变 IGF-1 基因表达并影响成年小鼠肝脏和血液中IGF-1含量，但未见生长发育变化。基于以上，本研究旨在明确IGF-1 c.258A＞G同义突变是否对老年小鼠SOP具有改善作用及其作用机制，期待挖掘该同义突变的存在意义及功能，同时为 SOP 机制的研究提供新思路。<br>　　首先利用IGF-1 c.258A＞G同义突变单碱基编辑小鼠及野生型小鼠（Ho， WT），采用 D-半乳糖诱导法构建 SOP 模型。利用 SOD、CAT、GSH-PX 和MDA 检测小鼠衰老相关指标，结果表明诱导衰老后小鼠 SOD、CAT、GSH-PX 活性显著降低，MDA 含量显著上升，SOP 模型构建成功。与此同时，监测WT和Ho SOP小鼠体重、计算脏器指数、胫骨长度及胫骨重量，结果发现两组间生长发育均未有显著差异。<br>　　为探究IGF-1 c.258A＞G同义突变是否影响SOP小鼠IGF-1表达，ELISA检测 WT 和 Ho 小鼠在不同生长发育时期血清中 IGF-1 含量。结果发现，Ho SOP小鼠显著抵抗衰老导致的IGF-1分泌减少（p＜0.01）。利用Micro-CT和组织学染色观察胫骨骨小梁形态结构，结果发现 WT SOP 小鼠骨密度显著下降，骨小梁微结构破坏严重，而Ho SOP小鼠显著增加骨密度，骨小梁体积分数和骨小梁数目，并显著降低骨小梁分离度和结构模式指数。Ho SOP 小鼠抵抗骨量减少并改善骨微结构，增加了成骨细胞数目，降低了破骨细胞数目，增加了胶原容积百分比。进一步通过qRT-PCR及ELISA检测骨形成及骨吸收相关基因的 mRNA 及蛋白质表达，结果发现该同义突变能显著促进骨形成相关基因及抑制骨吸收基因的 mRNA 及蛋白质表达。以上结果表明，该同义突变可以显著抵抗衰老导致IGF-1分泌减少，抵抗SOP引起的骨丢失。<br>　　基于IGF-1 c.258A＞G同义突变可以抵抗SOP引起的骨丢失，本研究通过体外实验来进一步探索 IGF-1 c.258A＞G 同义突变对衰老的成骨细胞破骨细胞增殖及分化的影响。分离WT和Ho小鼠前成骨细胞（CNCCs）和前破骨细胞（OCLs），利用 ALP、ARS 和 TRAP 染色进行鉴定，结果表明获得了两种基因型前成骨细胞（CNCC-IGF-1-A/G）及前破骨细胞（OCL-IGF-1-A/G）。同时，利用ABEmax碱基编辑器构建IGF-1 c.258A＞G同义突变MC3T3-E1细胞模型，鉴定基因型后，最终获得 MC3T3-IGF-1-G。利用 H2O2诱导构建成骨细胞衰老模型并用 β-半乳糖苷酶染色及衰老相关基因 qRT-PCR 检测进行衰老鉴定，结果表明，诱导后 β-半乳糖苷酶染色阳性率及衰老相关基因均显著升高，细胞衰老模型构建成功。利用两种不同来源的成骨细胞共同探索该同义突变对其增殖及分化的作用，后续实验均在细胞衰老模型的基础上进行实验。利用Western Blot检测CNCC-IGF-1-A（A组）与CNCC-IGF-1-G（G组）IGF-1和其受体IGF-1R蛋白表达量，结果显示G组IGF-1和IGF-1R的表达量显著高于 A 组（P＜0.05）。利用 CCK-8、EdU、细胞划痕实验及及成骨细胞增殖相关基因 qRT-PCR 检测探究该同义突变对成骨细胞增殖的影响。结果显示，G 组增殖能力、EdU 染色的阳性细胞、细胞迁移率及成骨细胞增殖相关基因表达水平均显著高于 A 组。进一步通过 ALP 活性和染色、茜素红染色、qRT-PCR和 ELISA 等检测成骨细胞分化指标，结果表明该同义突变促进成骨细胞的分化，促进成骨分化基因的 mRNA 和蛋白质的表达。MC3T3-IGF-1-A 与MC3T3-IGF-1-G 的实验结果与上述结果一致。利用 CCK-8、破骨细胞骨吸收能力的检测、细胞增殖及骨吸收相关基因 qRT-PCR 探究该同义突变对破骨细胞增殖和分化的影响，结果显示该同义突变对细胞增殖、增殖相关基因表达没有显著影响，影响骨吸收相关基因的表达但对于破骨细胞骨吸收功能没有显著影响。以上结果表明，IGF-1 c.258A＞G同义突变影响衰老的成骨细胞中IGF-1蛋白的表达量，促进衰老成骨细胞的增殖和分化，对衰老的破骨细胞增殖和分化没有影响。<br>　　成骨细胞与破骨细胞之间存在相互偶联作用。IGF-1 c.258A＞G 同义突变对成骨细胞以及破骨细胞的单独作用可能不能反映动物体骨稳态的真实情况。本实验利用Transwell 小室构建成骨-破骨共培养体系，探究该同义突变对共培养体系中成骨细胞活性及破骨细胞分化的影响。随后通过 ALP 染色、ARS 染色、TRAP 染色和破骨细胞骨吸收能力的检测鉴定共培养体系中成骨和破骨细胞活性，结果表明成骨-破骨共培养体系构建成功，成骨细胞具有成骨活性和破骨细胞具有骨吸收活性。利用qRT-PCR和ELISA检测共培养体系中骨形成及骨吸收相关基因的 mRNA 表达和蛋白表达，结果显示该同义突变促进成骨细胞 OPG、RANKL mRNA 以及蛋白的表达并且可以显著提高 OPG/RANKL的比值。<br>　　以上结果分别在动物和细胞水平解析了IGF-1 c.258A＞G同义突变对SOP改善作用及机制，为SOP机制的研究提供新思路。