检索历史 清除

摘要目的：探究在缺氧微环境下 Sestrin2（SESN2）对预血管化细胞膜片体内外成血管能力的影响，以期为工程化组织成功移植提供新的思路。<br>　　方法：以慢病毒为载体，转染获得由绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）标记的稳定高表达 SESN2 的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。使用荧光显微镜以及Western-blot（WB）检测转染效率及SESN2蛋白表达情况。选用全骨髓贴壁法提取兔骨髓间充质干细胞（rabbit Bone mesenchymal stem cells，rBMSCs），经过传代纯化后，将第二代rBMSCs按照2.0×105/孔的密度接种到六孔板中，隔天更换为含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素溶液、1% L-谷氨酰胺以及50 mg/L抗坏血酸的高糖DMEM培养基（锡纸避光），连续培养形成rBMSCs细胞膜片。将转染SESN2的HUVECs（SESN2组）按照5.0×104/cm2的密度接种到rBMSCs细胞膜片，分别在常氧和缺氧条件下培养1、3、7天后进行检测：倒置荧光显微镜下观察细胞排列；细胞增殖/毒性检测试剂盒（Cell counting kit，CCK-8）检测SESN2对HUVECs活力的影响；CD31 免疫荧光检测观察血管网的形成；酶联免疫吸附实验（ Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）和实时定量逆转录-聚合酶链式反应（quantitative Reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测血管内皮生长因子-A（Vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）和血小板衍生生长因子-BB （Platelet-derived growth factor subunit-B，PDGF-BB）表达情况。体内实验将转染SESN2的预血管化细胞膜片移植到裸鼠皮下，分别在1、7、14天进行大体观察、苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining，HE staining）、CD31免疫荧光检测血管生成情况。<br>　　结果：（1）慢病毒转染后，可以成功获得高表达SESN2的HUVECs稳转株，转染效率达到90%以上；CCK-8细胞增殖实验显示SESN2高表达扭转了缺氧对HUVECs增殖的抑制作用，且慢病毒转染并未影响细胞增殖；（2）使用全骨髓贴壁法可以成功提取rBMSCs，流式检测显示间充质干细胞表面标志物CD29阳性表达率95.5%，CD44阳性表达率96.6%，CD34阳性表达率0.57%，CD45阳性表达率0.58%；（3）高密度接种rBMSCs并使用特定培养基连续培养14天，形成了细胞膜片；（4）CD31 免疫荧光染色显示 SESN2 能在缺氧环境中显著促进HUVECs重排，促进血管网络结构的形成。高表达SESN2可以显著提高预血管化细胞膜片促血管生成相关细胞因子VEGF-A和PDGF-BB的释放，且VEGF-A在成血管早期释放，而PDGF-BB则在血管生成的晚期释放；（5）在体内实验中，大体观察显示高表达SESN2可以促进血管网络形成，HE染色结果提示体外预构的血管网络结构与宿主血管发生吻合，形成功能性血管网。<br>　　结论：SESN2能有效的提高内皮细胞对缺氧微环境的适应能力，促进预血管化细胞膜片血管网络结构的形成。