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摘要背景和目的：人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells， hMSCs）可以来源于骨髓、脐带、脂肪等诸多组织，已广泛应用于再生医学、组织工程、细胞治疗等领域，但存在来源有限、体外扩增能力不足、复制性衰老等问题。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）可以来源于患者自身细胞，具有无限增殖和多向分化潜能，且通过体外诱导分化能获得人诱导多能干细胞来源间充质样细胞（ human induced pluripotent stem cells derived mesenchymal stem cells, hiPSCs-MSCs）。遗憾的是，现有诱导分化方法多直接使用含血清的间充质培养基，存在成分不明确、诱导分化率低等问题。更为重要的是，间充质细胞缺乏特异性标志物，连续传代导致细胞衰老，亟需开发有效的细胞纯化方法。<br>　　方法：采用广泛使用的拟胚体诱导方法，将 hiPSCs体外分化为间充质样细胞。以含血清拟胚体培养基为对照，将 hiPSCs来源拟胚体转移至超低粘附板中并使用成分明确的 E6培养基培养 5天。利用 CCK8、RT-PCR和流式细胞术等方法，研究不同阶段添加功能化合物 TGF-β和 RA对细胞存活和间充质向分化效率的影响。确定理想的悬浮培养基后，使用成分明确的间充质培养基进行 10天的贴壁培养。以 Matrigel 为对照，对比不同成分明确培养表面（明胶或多肽修饰表面）对拟胚体细胞生长和间充质分化效率的影响。然后，制备不同宽度（ 0μm, 5μm, 10μm, 20μm, 40μm ）的聚二甲基硅氧烷（ Polydimethylsiloxan ， PDMS ）微图案化表面, 并利用聚 N-异丙基丙烯酰胺（ Poly （ N-isopropylacrylamide）PNIPAAm）温敏涂层和明胶进行修饰。使用 X 射线光电子能谱（XPS），原子力显微镜（AFM），水接触角等方法进行表征。继而，将上述表面获得的间充质样细胞，以单细胞接种至微图案化表面，研究沟槽宽度对 hiPSC-MSCs的纯化作用。最后，将获得的 hiPSCs-MSCs进行细胞鉴定，并且与脐带来源的成体间充质干细胞（hUMSCs）进行增殖能力以及多潜能分化鉴定对比。<br>　　结果：拟胚体悬浮培养 5天，在后 3天（D3-D5阶段）使用添加功能化合物 40ng/mL RA 的 E6 培养基，可以促进中胚层和间充质向分化。贴壁培养阶段，RT-PCR显示明胶表面CD73、CD44、CD29、CD45、CD90和 CD105基因表达量高以及流式细胞术显示明胶表面 CD73 和 CD44 阳性表达量最高，确定明胶修饰表面为理想表面。然后，AFM 证实成功获得了不同宽度的沟槽图案化表面。XPS 全谱图观察到酰胺键C=O伸缩振动的特征吸收峰，显示成功制备了温敏涂层。细胞实验证实，相比于胰酶消化，温敏涂层可以显著地提高细胞的存活率。更为重要的是，培养在 20μm 宽度表面的细胞，呈现均一的间充质样细胞形貌以及高表达 CD73、CD44、CD29、CD45、CD90 和 CD105 间充质标记物 。最后，获得的CD73+CD44+hiPSCs-MSCs，具有与hUMSCs相当的体外扩增和多潜能分化能力。<br>　　结论：本研究利用拟胚体法和成分明确培养基，成功构建 hiPSCs-MSCs 体外诱导分化培养体系。而且，利用温敏涂层微图案化表面机械性“接触引导”促进 hiPSCs-MSCs 的纯化，高效率获得可用于临床的间充质样细胞。本项目结果有助于推进 hiPSCs-MSCs 在组织工程、修复、基因治疗和细胞移植等领域的应用，具有较大的科学研究意义和经济价值。