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DDR1通过激活NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡促进小鼠实验性结肠炎的实验研究

摘要目的:探讨DDR1对实验性结肠炎小鼠NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡的影响及其可能的机制。<br>  方法:1. SPF级野生型雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,20±2g)随机分为4组:WT NC组、WT DSS组、WT DSS+低剂量达沙替尼组(4mg/kg/d)和WT DSS+高剂量达沙替尼组(8mg/kg/d),WT NC组小鼠自由饮用水,其余三组小鼠自由饮用3.5% DSS,为期7天用于建立急性结肠炎模型,并在第8天麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,收集小鼠结肠及脾脏:(1)每日观察小鼠精神状态、毛发光泽度、饮食饮水量,记录小鼠体重、大便性状及血便情况,计算小鼠体重变化率及疾病活动指数(Disease activity index,DAI);(2)第8天处死小鼠后,记录小鼠结肠长度,称取脾脏重量并计算脾指数;(3)取小鼠结肠最下端约1cm组织用于HE染色并在镜下观察结肠结构变化,随后进行结肠组织病理学评分;(4)qRT-PCR检测各组小鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1及GSDMD的mRNA表达水平。<br>  2. 体外培养内源性表达DDR1的小鼠J774A.1巨噬细胞:(1)CCK8检测达沙替尼对J774A.1细胞的细胞毒性,计算IC50;(2)Western blot验证达沙替尼对DDR1磷酸化的抑制作用;(3)细胞分为三组:Control组、LPS组和Dasatinib+LPS组,western blot检测各组细胞NLRP3、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、GSDMD及N-GSDMD的蛋白表达情况:(4)qRT-PCR检测各组细胞NLRP3、caspase-1及GSDMD的mRNA水平;(5)qRT-PCR、ELISA检测各组细胞IL-1β和IL-6的表达水平。<br>  结果:1. 用3.5%DSS诱导急性结肠炎模型,结果显示:(1)与WT NC组小鼠相比,WT DSS组小鼠一般情况较差,体重明显下降、DAI评分明显升高,低剂量和高剂量达沙替尼均可缓解DSS诱导的体重下降和DAI评分升高,并且高剂量达沙替尼的效果更明显;(2)与WT DSS组小鼠相比,WT DSS+低剂量达沙替尼组小鼠和WT DSS+高剂量达沙替尼组小鼠结肠长度更长(5.88±0.32 vs 4.95±0.17,plt;0.01;6.73±0.19 vs 4.95±0.17,plt;0.0001),脾脏指数更低(5.67±0.90amp;nbsp;vs 8.35±0.37,plt;0.001;3.88±0.69 vs 8.35±0.37,plt;0.0001);(3)与WT DSS组小鼠相比,WT DSS+低剂量达沙替尼组小鼠和WT DSS+高剂量达沙替尼组小鼠结肠病理学评分降低(9.33±0.58 vs 12.33±0.58,plt;0.05;5.00±1.73 vs 12.33±0.58, plt;0.0001);(4)qRT-PCR结果显示,与WT DSS组小鼠相比,WT DSS+低剂量达沙替尼组小鼠和 WT DSS+高剂量达沙替尼组小鼠 NLRP3 mRNA 表达降低(29.61±5.02 vs 134.50±7.63,plt;0.0001;12.83±3.01 vs 134.50±7.63,plt;0.0001)、NLRP3炎症小体激活指标caspase-1 mRNA表达降低(6.71±1.83 vs 20.71±3.06, plt;0.0001;1.48±0.82 vs 20.71±3.06,plt;0.0001)、焦亡关键蛋白GSDMD mRNA表达降低(10.88±2.32 vs 33.43±4,76,plt;0.0001;3.30±0.59 vs 33.43±4,76,plt;0.0001)。<br>  2. 细胞实验结果:(1)达沙替尼剂量依赖性的抑制J774A.1细胞活性,IC50=2.9nM;(2)与胶原Ⅰ(CollagenⅠ,ColⅠ)刺激的J774A.1细胞相比,达沙替尼可抑制DDR1的磷酸化(0.68±0.07 vs 0.90±0.06,plt;0.05);(3)Western blot结果显示:与 LPS 组相比,Dasatinib + LPS 组 J774A.1 细胞蛋白 NLRP3 表达降低( 0.90±0.16 vs 0.36±0.04 , plt;0.01 )、 pro-caspase-1 表达降低( 1.04±0.15 vs 0.64±0.02,plt;0.01)、cleaved-caspase-1表达降低(1.09±0.04 vs 0.69±0.10,plt;0.01)、GSDMD 表达降低( 1.06±0.06 vs 0.84±0.01 , plt;0.05 )、N-GSDMD 表达降低(0.47±0.15 vs 0.79±0.10,plt;0.05);(4)qRT-PCR结果显示:与LPS组相比, Dasatinib+LPS组J774A.1细胞NLRP3 mRNA表达降低(0.98±0.28 vs 1.64±0.09, plt;0.01)、caspase-1 mRNA表达降低(1.57±0.62 vs 2.94±0.65,plt;0.05)、GSDMD mRNA表达降低(1.35±0.12 vs 2.22±0.57,plt;0.05);(5)qRT-PCR结果显示:与LPS 组相比, Dasatinib + LPS 组 J774A.1 细胞 IL-1β 及 IL-6 表达降低( 373.50±104.50 vs 1057±129.30 , plt;0.0001;38.40±28.22 vs 700.80±112.70 , plt;0.0001);ELISA结果也提示达沙替尼可抑制LPS诱导的IL-1β及IL-6水平的升高(16.71±0.57 vs 21.43±2.37,plt;0.05;208.0±17.11 vs 583.80±33.82,plt;0.0001)。<br>  结论:(1)抑制DDR1可明显缓解DSS诱导的小鼠实验性结肠炎;(2) DDR1通过调节NLRP3炎症小体介导的巨噬细胞焦亡促进结肠炎的发生。

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