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摘要新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2，简称新冠)感染危害严重，可引起 2019冠状病毒病（ Coronavirus disease 2019 ， COVID-19)。截止2022年12月30日，新冠病毒已造成世界超过6亿人感染，超过660万人死亡。目前，针对新冠肺炎的疫苗，除灭活疫苗外其他疫苗的主要抗原成分均为SARS-COV-2表面的Spike（S）蛋白。S蛋白通过其RBD结构域（Recepter Binding Domain, RBD）识别宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶E2（ACE2），介导病毒进入宿主细胞，RBD结构域的氨基酸变异会导致病毒的种属特异性和感染特性的变化,它含有整个SARS-COV-2病毒中最具免疫显性的中和表位，新冠感染患者90%以上的中和抗体都由RBD抗原诱导产生，RBD能够在机体内引发有效的免疫应答，从而达到保护机体免受病毒侵害的作用。但是目前在不同佐剂及免疫途径下RBD的免疫优势表位及其作用机制还不清楚。为了提高以RBD为主要组分的新冠疫苗的免疫应答保护效果，本论文研究了新冠病毒RBD在不同佐剂及免疫途径下的免疫优势应答谱学，为疫苗优化设计提供理论基础和实践依据。<br>　　目的：<br>　　本论文旨在探究RBD在不同佐剂及不同免疫途径下诱导的免疫优势B细胞应答，明确在不同佐剂及免疫途径下的保护性免疫优势表位肽，为新冠疫苗的优化设计提供一定的理论基础和实践依据。<br>　　方法：<br>　　（ 1 ） RBD蛋白的表达和纯化：将从PubMed获取的新冠病毒S蛋白（ ID号MN908947 ） RBD区域的编码序列（ 319-529 ）克隆至pcDNA3.1载体的BamH1和Xho1位点之间，构建重组表达质粒pcDNA3.1-RBD。进一步转染至HEK-293F细胞进行重组蛋白的表达。经Ni2+填料亲和层析纯化，经SDS-PAGE电泳验证重组RBD蛋白的表达及纯度，BCA法测定重组RBD蛋白浓度。<br>　　（2）分析重组RBD在不同佐剂及免疫途径下的动物免疫保护效果：在0 d、14 d、21 d免疫6-8周雌性BALB/c小鼠。ELISA法测定在不同佐剂及免疫途径下的RBD特异性IgG中和抗体滴度及其亚型。<br>　　（3）评价重组RBD免疫后抗血清对ACE2的阻断作用以及对不同假病毒株的中和作用：采集不同佐剂及免疫途径下的RBD抗血清，细胞实验检测RBD抗血清对新冠病毒原始株、新冠病毒变异Delta株（ B.1.617.2 ）以及新冠病毒变异Omicron株（B.1.1.529）的假病毒株入侵细胞能力的阻断作用。<br>　　（4）B细胞免疫优势表位的鉴定：步移重叠肽法设计覆盖RBD全长的的18氨基酸重叠肽，并进行肽段的合成。ELISA法鉴定在不同佐剂及免疫途径下RBD的线性B细胞免疫优势表位。<br>　　（5）RBD的B细胞免疫优势表位的定位及功能分析：生物信息学分析B细胞免疫优势表位在RBD晶体结构中的位置，分析这些表位在以RBD为抗原的疫苗发挥保护效果中的可能作用，以及这些表位在不同SARS-COV-2野生型、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株和Omicron变异株的RBD的氨基酸序列。<br>　　结果：<br>　　（1）经亲和层析和脱盐后SDS-PAGE电泳测定，结果显示SARS-COV-2保护性抗原RBD的纯度高达98%。经BCA测定， RBD的蛋白浓度约为2 mg/mL ，-80℃保存，备用。<br>　　（ 2 ）本研究成功对RBD+AddaVax （肌内免疫）、RBD+AddaVax （鼻内免疫）、AddaVax（肌内免疫）、AddaVax（鼻内免疫）、RBD+AS03（肌内免疫）、AS03（肌内免疫）、RBD+Al(OH)3（肌内免疫）、Al(OH)3 （肌内免疫）8组小鼠在第0 d、14 d、21 d进行了三次免疫，在末次免疫后一周获得小鼠血清和小鼠脾脏用于后续实验，通过ELISA检测结果显示在不同佐剂及免疫途径下，RBD免疫小鼠都会出现特异性IgG水平的升高，且主要是IgG1水平的升高，同时本实验中选用的两种新型佐剂AddaVax和AS03产生的抗体滴度显著高于常规佐剂Al(OH)3。<br>　　（3）RBD在不同佐剂经不同免疫途径下免疫后的小鼠血清中产生的中和抗体能够竞争抑制ACE2与细胞的结合，是防止感染的关键。同时该抗体对SARS-COV-2病毒株具有交叉保护作用。<br>　　（4）步移6个氨基酸，合成覆盖RBD氨基酸全长的重叠18-mer肽，并委托上海吉尔生化有限公司进行合成。合成后的肽纯度均大于95%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解至1 mg/mL ，储存在-80℃保存，备用。实验结果显示RBD+AddaVax鼻内免疫小鼠RBD61-78，RBD97-114显示出明显的表位优势，在RBD+AddaVax肌内注射小鼠中RBD145-162显示出明显的免疫优势。在RBD+Al(OH)3肌内注射免疫下，RBD49-66、RBD145-162显示出明显的免疫优势，在 RBD+AS03肌内注射免疫下， RBD1-18、RBD139-156、RBD145-162显示出明显的免疫优势。<br>　　（5）在蛋白质数据库中（Protein Database, PDB）中获得RBD蛋白晶体结构，定位本实验中发现的六个表位在蛋白质中的位置，结果显示所有表位都位于蛋白质晶体结构的表面，这更有利于抗原与特异性抗体的结合，引发免疫应答反应。GenBank数据库中检索随机选择 SARS-COV-2野生型毒株以及 Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron变异毒株的RBD氨基酸序列进行比对，本研究中确定的六个免疫显性表位的序列都是高度保守的，氨基酸序列一致，高达99.5%。<br>　　结论：<br>　　本研究表明，佐剂和免疫途径在很大程度上能够影响RBD的免疫优势表位和保护作用，本研究中选用的两种新型佐剂AddaVax和AS03以及筛选出来的六个表位对于新型冠状病毒疫苗开发和进一步优化具有重要指导作用。