检索历史 清除

摘要脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）的恶性程度最高，复发及放化疗抵抗现象明显。尽管伴随手术方式和辅助治疗措施地大幅改进，但其预后仍远不能令人满意，GBM 患者平均中位生存时间仅为14.6个月。因此，了解 GBM起源和进展的分子机制至关重要，肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，通常由异常的遗传或表观遗传变化引起。表观遗传异常主要发生在DNA、RNA和组蛋白修饰等层面，对于RNA而言，目前已鉴定出了百余种类型的转录后修饰，其中，N6-甲基腺苷（m6A）修饰是最常见的修饰类型之一，约占总甲基化核糖核苷酸的50%。<br>　　m6A 修饰作为真核细胞中最主要的 mRNA 修饰形式，是一个可逆的化学过程，由甲基化转移酶和去甲基化酶的平衡活性动态控制。其中，甲基化转移酶（Methyltransferase like 3, METTL3）作为最早发现也是最重要的甲基转移酶，它参与了RNA生命周期的所有阶段。其在mRNA前体剪接、3’端加工、核输出、翻译调节、衰减和miRNA成熟中均发挥关键作用。因此，METTL3 能够通过调控关键癌基因或抑癌基因 mRNA 中的m6A 修饰来影响肿瘤的形成。有趣的是，除了 mRNA，众所周知的非编码 RNA-环状RNA（简称circRNA，是一种共价连接的单链闭合环状RNA分子，没有3’端poly（A）尾和5’端帽子）上也具有广泛的m6A修饰位点，而且circRNA与胶质瘤的发生发展密切相关。研究显示，METTL3可以促进m6A-circRNA的形成，同时表现出与mRNA完全不同的m6A修饰模式，但是METTL3介导的m6A修饰调控circRNA及其下游靶标在胶质瘤发生发展中的作用机制仍然未知。本研究以“m6A修饰调控circRNA”和“circRNA的 RBP 功能”作为切入点，提出了“甲基化转移酶 METTL3 介导的 m6A 修饰调控circRNA/RBP途径促进胶质瘤发生发展”的科学假设。<br>　　研究目标：<br>　　基于课题组前期circRNA的m6A测序以及转录组测序，联合生信分析、细胞（体 外）实验、动物（体内）实验和临床水平研究验证“甲基化转移酶METTL3介导的m6A修饰调控circRNA/RBP途径促进胶质瘤发生发展”的功能和机制假设，探索m6A修饰在胶质瘤生物学起源及其恶性进展中的重要作用，丰富肿瘤学调控的互作网络。预计为胶质瘤的早期诊断、病理分级、靶向治疗和预后评估等打开新的视角，同时也为深入研究m6A修饰调控非编码RNA在胶质瘤中发挥的关键作用提供一定的理论和实验依据。具体研究内容如下：<br>　　研究方法：<br>　　（1）基于临床GBM和正常非肿瘤脑组织样本，进行RNA甲基化测序（m6A-Seq）和RNA转录组测序（circRNA-Seq），针对测序结果进行高级生物信息学分析。对m6A相关兴趣circRNA进行免疫沉淀，RT-qPCR完成circRNA m6A修饰水平和表达水平验证，筛选得到目标circRNA。<br>　　（2）采用siRNA技术联合RT-qPCR验证完成RNA敲减，EdU实验、流式细胞术及Transwell实验对METTL3以及筛选得到的目标circRNA进行胶质瘤细胞功能实验。慢病毒构建稳定转染的METTL3敲减细胞模型，裸鼠异种移植技术探讨METTL3在体内对胶质瘤生长的影响。<br>　　（3）构建目标circRNA野生型和突变型质粒，MeRIP-qPCR（又称m6A-qPCR）、RT-qPCR联合m6A点突变探讨METTL3对circRNA的调控作用。EdU实验通过Rescue进一步验证下游目标circRNA的促癌作用。CHIRP联合质谱分析确定目标circRNA结合蛋白，RIP实验反向确认二者的结合作用。circRNA成环实验验证其环状属性。RT-qPCR、WB及免疫组化检测裸鼠肿瘤组织目标基因及蛋白的表达水平。<br>　　研究结果：<br>　　（1）与NC组相比，来自GBM的circRNA中有1370个新的m6A峰和1322个缺失的m6A峰。在与m6A峰变化相关的位点中，有1298个上调，1905个下调。m6A修饰水平与circRNA表达呈正相关。生物信息学分析预测了m6A修饰的circRNA的生物学功能和相应信号通路。此外，通过 RT-qPCR 验证结合临床数据挖掘，确定了 3 个兴趣分子（TNFRSF19、DLGAP5和NDC80），作为进一步研究m6A修饰介导GBM发生发展的功能和机制的初步候选circRNA。<br>　　（2）小干扰RNA瞬转和慢病毒稳转敲减RNA胶质瘤细胞模型构建成功。METTL3 以及相关兴趣circRNA（circ-TNFRSF19和circ-NDC80）表达水平下调后，胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著减弱，细胞凋亡增加。此外，与对照组相比，METTL3敲减后，裸鼠异种移植瘤在体内生长速度减慢，瘤体质量和体积均减小。<br>　　（3）circ-TNFRSF19 上存在广泛 m6A 修饰位点且成环实验证实了其环形结构。METTL3敲减后，circ-TNFRSF19的甲基化水平和表达水平显著下调，m6A序列点突变后这种调控效应失效。恢复实验结果显示 METTL3 敲减后导致的细胞增殖抑制可以通过过表达circ-TNFRSF19恢复。circ-TNFRSF19可结合多种核糖体蛋白，基于ORFfinder预测到其可能的两种翻译产物（氨基酸个数分别为148aa和74aa）。<br>　　研究结论：<br>　　（1）本研究的发现提供了人类GBM中circRNA的m6A修饰的第一张图谱，并鉴定了与高甲基化和低甲基化修饰相关的差异表达circRNA转录物，揭示了异常m6A修饰与癌症相关基因表达和功能之间的潜在关联，这对于进一步深入探讨RNA甲基化修饰调控circRNA表达及其功能具有重要的意义。<br>　　（2）甲基化转移酶METTL3在体内和体外可显著促进胶质瘤的发生发展。针对测序筛选得到的高m6A修饰水平和高表达水平的circ-TNFRSF19和circ-NDC80，它们也可以增强胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，同时抑制其凋亡，在促进肿瘤恶性进展方面发挥重要作用。<br>　　（3）circ-TNFRSF19上存在广泛m6A修饰位点，METTL3通过m6A依赖的方式正向调控致癌 circ-TNFRSF19 的甲基化水平和转录水平并影响肿瘤驱动效应。此外， circ-TNFRSF19通过与核糖体蛋白结合，潜在翻译出数种多肽产物进而在胶质瘤的恶性进展中发挥作用。<br>　　总之，这项研究强调了METTL3介导的m6A修饰通过调控circ-TNFRSF19翻译途径，在胶质瘤的发生发展中起到促癌作用。不仅为深入理解m6A修饰调控下的circRNA对胶质瘤影响的相关机制提供实验依据，也为胶质瘤的靶向治疗提供了新的思路。