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摘要我国人口老龄化的日益严重、快节奏的生活方式、不健康的饮食结构等均成为急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke，AIS）的诱发因素，而且发病人群逐渐趋向年轻化，脑卒中已成为我国首位死亡原因，对个人、家庭及社会造成了极大负担。临床表现及影像学检查依然是AIS的诊断及评估严重程度的主要方式。由于对该疾病的认识不足，其发病特点不典型、影像学表现延迟，导致诊断不及时，错过最佳治疗时间。因此，探索血清中的生物学标志物作为急性缺血性脑卒中的辅助诊断或治疗干预靶点，有利于疾病的早发现、早治疗，提高血管再通率，降低脑神经元的死亡率，最大可能挽救缺血半暗带，减少神经功能损伤，从而改善患者预后，具有非常重要的意义。<br>　　近年来，随着对miRNA的认识越来越深入，大量研究发现miRNA表达量的上调或下调参与了各种疾病的发生、发展，依据其表达水平的变化，为临床诊断提供参考。另有研究表明，在同种疾病的不同发生阶段miRNA的表达水平有着差异性变化。本实验第一部分通过对健康人群与发病在24小时内AIS（急性期）及其住院7d （软化期）患者血清相关miRNA的检测（包括miR-133b及miR-296-5p），观察其表达是否具有差异。进一步分析其与神经损伤严重程度是否相关，并探讨与血常规及生化相关指标之间的相关性，分析影响患者3个月远期预后的可能相关因素；第二部分通过对PC12高分化细胞进行缺血缺氧造模，体外验证miRNA-133b在缺血缺氧情况下的表达变化，进一步探究miRNA-133b在体内、体外表达水平之间的关系。<br>　　第一部分 急性缺血性脑卒中患者血清miR-133b和miR-296-5p表达水平分析<br>　　目的：<br>　　1.比较健康人群与急性缺血性脑卒中患者24小时内及住院第7天血清miR-133b和miR-296-5p表达水平；<br>　　2.分析脑梗死患者血清miR-133b、miR-296-5p表达水平与神经损伤、血常规中炎症因子及3个月预后的相关性；并评估对AIS的临床诊断价值。<br>　　方法：<br>　　1.选取于2021年12月1日至2022年6月25日收入联勤保障部队第981医院神经内科发病24小时内的急性缺血性脑卒中患者35例，按同一患者的病程分为入院组和住院7d组，另选取同期于我院体检的健康者33例为对照组，收集所有入组者的外周血，并记录其性别、年龄、血压、体质指数；高血压、糖尿病、冠心病等慢性病史；吸烟、饮酒等个人史等基线资料，对入组患者分别于入院时及住院7d进行美国国立卫生研究院卒中量表（ National Institute of Health stroke scale ， NIHSS）评分，结合影像学及症状、体征按急性卒中治疗Org10172试验（Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）区分脑梗死病因。所有患者入院时均进行血常规、生化、凝血等相关检测，并且按指南要求进行标准抗栓治疗及针对性功能康复治疗。<br>　　2.采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time qR-PCR）技术检测所有纳入者血清中miR-133b和miR-296-5p表达，通过加入外参采用茎环法进行相对定量检测，用2-ΔΔCT计算出相对值比较分析。再用SPSS.26版统计软件绘制出接受者操作特性曲线（ receiver operating characteristic curve，ROC），并计算出曲线下面积（Area Under Curve， AUC），分析对AIS的诊断评估价值；<br>　　3.分析脑梗死组中miR-133b和miR-296-5p与其入院时及住院7d的NIHSS评分之间的关系；<br>　　4.分析脑梗死入院当天miR-133b和miR-296-5p与血常规（白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞绝对值等）、生化、凝血功能指标、入院血压（收缩压、舒张压）等之间的关系；<br>　　5.通过电话或面诊的方式对脑梗死组患者出院3个月后进行回访，用改良RANKIN量表（Modified Rankin Scale，mRS）对其3个月的神经恢复状况进行评定，分析影响3个月预后的相关因素，并按mRS≤2分、mRS＞2分区分为预后良好和预后不良两种情况，用二元Logistic回归分析探讨影响AIS预后的独立危险因素。<br>　　结果：<br>　　1.本实验共纳入35例AIS患者，其中男性24名，女性11名；平均年龄为64（54.5，71.5）岁，入院收缩压161.1±20.2mmHg、入院舒张压90.8±13.8 mmHg，体质指数22.8（20.2，26.8），入院时及住院7d NIHSS评分分别为4.89±3.64、3.43±2.82，根据TOAST病因分型17例为大动脉粥样硬化性脑卒中、17例为小动脉闭塞型脑卒中、1例心源性脑卒中；健康对照组中，男性24例，女性9例，平均年龄为22（22， 24）岁，与急性脑梗死组基线资料对比，只有性别和体质指数无统计学差异（P＞0.05），健康对照组符合实验要求；<br>　　2.miR-133b检测水平在急性脑梗死患者入院时为0.05（0.02，0.20），与健康组人群0.56（0.37，1.03）相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；在住院7d时表达水平升高至0.40（0.29，3.54），与入院时相比有统计学意义（P＜0.05）,而与健康组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；AIS组入院时的miR-133b的ROC曲线下面积AUC为0.867 （P＜0.05），95%CI：（0.771-0.062），特异度为0.879、敏感度0.743；<br>　　3.miRNA-296-5p在急性脑梗死入院时0.96（0.42，2.39）与健康组水平为0.33（0.11，4.07）表达无明显差异（P＞0.05）；而在住院7d时为1.98（0.49，11.66）表达上升，与健康组和急性期相比差异有均统计学意义（P＜0.05）;ROC曲线下面积为0.446，P＞0.05无统计学差异；<br>　　4.AIS患者入院时的miR-133b与入院时的NIHSS评分呈负相关（r=-0.409，P＜0.05），住院7d的miR-133b与住院7d时的NIHSS评分同样呈负相关（r=-0.388，P＜0.05）；miR-296-5p与急性脑梗死组入院时及其住院7d的NIHSS评分值均无明显相关性（P＞0.05）；<br>　　5.急性脑梗死组入院血清中miR-133b与中性粒细胞绝对值、纤维蛋白（原）降解产物均为负相关，相关系数分别为-0.339、-0.344，均有统计学意义（P＜0.05）；而miR-296-5p与中性粒细胞、纤维蛋白（原）降解产物、以及入院血压均未见明显相关性（P＞0.05）；<br>　　6.3个月预后回访结果：平均mRS为1.31±1.41，包括8人预后不良（22.9%），27人预后良好（77.1%），无死亡病例；用Spearman分析影响神经功能预后的相关因素发现：年龄、入院时NIHSS评分、同型半胱氨酸、活化部分凝血酶与预后呈正相关，相关系数分别为0.47、0.592、0.348、0.336；与入院miR-133b、胆碱酯酶、Ca2+呈负相关，相关系数分别为-0.363、-0.382、-0.386，有统计学意义（P＜0.05）；而miR-296-5p与入院血压、TOAST分型等未见明显相关性。以上相关因子用二元Logistic分析，结果表明入院NIHSS评分是预后独立危险因素（P＜0.05），其它指标与预后有相关性，但非独立危险因素。<br>　　结论：<br>　　1. miR-133b可能作为诊断AIS潜在生物学标志物，其可能通过抗凝或抗炎机制参与AIS病理过程，且与病情严重程度呈负相关。<br>　　2.miR-296-5p可能成为AIS治疗干预靶点。<br>　　第二部分 miRNA-133b在PC12细胞中的表达情况<br>　　目的：<br>　　分析对源自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株经神经生长因子刺激后高分化PC12细胞进行糖氧剥夺（OGD）模型后复氧24h，在体外细胞中检测miR-133b的表达水平情况，验证与AIS患者外周血中表达是否一致。<br>　　方法：<br>　　1.从武汉普诺赛生命科技有限公司购买高分化PC12细胞株，待细胞传6至7代后种板，后经CO2培养箱培养24h，进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R），按造模前、后分为对照组和实验组；<br>　　2.检测造模成功与否:（1）通过观察细胞形态学前、后变化；（2）用细胞增殖及毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测实验组与对照组细胞活力值；<br>　　3.通过实时荧光PCR技术，采用同时检测细胞内参U6，计算出miRNA-133b的相对表达量，并分析其表达情况。<br>　　结果：<br>　　1. PC12细胞糖氧剥夺（OGD）造模后，紧贴培养瓶的细胞脱落、松散漂浮于培养液中，交织成网的神经突触消失，细胞成椭圆型；由CCK-8试剂检测出造模后的存活率为造模前的40%。<br>　　2.复氧24h后，miR-133b在实验组和对照组的表达水平分别为0.005 ±0.002、1.51±1.22，实验组显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　miR-133b在PC12细胞在OGD造模复氧24h后，表达显著降低，与病程24h的AIS患者外周血中的表达一致。