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摘要如何治愈并防止单基因遗传病传递给后代，实现这部分夫妻孕育健康后代的梦想，是目前亟待解决的问题，这需要在生殖细胞水平进行基因编辑治疗。G6PC3基因作为重型先天性中性粒细胞减少症(Severe Congenital Neutropenia Type 4， SCN4)的一大致病基因，其突变形式以单个碱基突变为主，可用于研究碱基编辑对遗传病治疗的效果。该病会导致中性粒细胞减少和功能障碍，患病儿童会发生严重的感染、严重者可累及心脏、泌尿、生殖系统异常等。碱基编辑技术是一种治疗遗传病的新兴方法，可通过碱基编辑工具对致病突变进行校正，从而恢复其编码蛋白的正常功能，达到治疗遗传病的目的。其中，规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白核酸内切酶系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)为第三代碱基编辑技术，被广泛地应用于生物学研究。尤其是基于CRISPR/Cas系统开发的单碱基编辑器(Base Editors，BEs)更是应用在单个碱基的精准编辑上。它可通过Cas9切口酶和相应脱氨酶对特定的碱基进行编辑，在不诱导DNA双链断裂的情况下介导嘧啶到嘧啶，嘌呤到嘌呤之间的转换，达到基因编辑的目的。虽然碱基编辑技术距离临床应用还有一定距离，但其已被广泛应用于培育良种、构建疾病模型等方面。<br>　　我们在临床上发现了一例SCN4患者，经采集全血基因检测后发现患者存在两处杂合变异：c.295C＞T，将谷氨酰胺转化为终止密码子；c.766-768del，导致氨基酸改变p.256-256del（缺失）。两种碱基突变分别来自患者父母。本研究对G6PC3基因突变所致SCN4患儿及其父母进行了临床特征及基因检测，利用CRISPR/Cas9技术构建了含该G6PC3基因突变的细胞系作为细胞模型，并基于患者父亲存在的单碱基突变的精细胞用于突变胚胎的构建，采用单碱基编辑器在细胞层面和胚胎水平纠正致病基因，探究细胞系及胚胎纠正的效果及安全性。研究结果如下：<br>　　（1）采用CRISPR/Cas9和体外模板构建HEK293T突变细胞系：应用Cas9及ssODN瞬转，成功构建了两株293C295T突变细胞系；<br>　　（2）采用ABE7.10和sgRNA在293C295T突变细胞系中校正突变：根据突变碱基位点，设计了三个不同的Re-sgRNA，3个Re-sgRNA（A13、A8、A1）在突变位点的编辑效率分别为14.99%、19.56%和8.97%；在细胞中，ABE7.10编辑器除了对目标位点进行编辑以外，还在其附近进行了非靶位点的编辑。<br>　　（3）采用ABE7.10校正致病胚胎：对18个胚胎进行编辑，共获得16个完全纠正的胚胎，校正效率达到了88.89%；同时，除了理想的校正外，在非靶位点上也检测到了明显的编辑现象，有44.44%的胚胎由无义突变转变成了错义突变，所编码的氨基酸从苯丙氨酸转换为脯氨酸或者亮氨酸。<br>　　（4）采用深度测序对胚胎潜在脱靶位点进行脱靶分析：使用深度测序对4个sgRNA的32个潜在脱靶序列进行检测，共计检测了61个位点。除OTS11G5以外，其余的转换效率均低于0.5%。<br>　　通过上述研究我们建立了一种新的基于人类致病胚胎的碱基纠正策略。它具有有效性、精确性和安全性。值得注意的是，使用的编辑工具受限于PAM位点，设计的两个sgRNA包含的目标位点均未在编辑窗口中，而且，还产生了一定的副产物，造成了编码氨基酸的改变，可能同样会影响该基因的功能。理论上这些限制可以通过使用基于新的Cas变体的碱基编辑器来规避，使绝大多数致病性突变具有靶向性。后续将尝试采用现有开发的编辑器变体或者不受PAM位点限制且精确地编辑碱基编辑器。本研究是ABE7.10介导SCN4治疗的首个案例，该策略不仅为治疗SCN4疾病，而且还为其他遗传病的治疗提供了一种新的思路。