检索历史 清除

摘要背景与目的：<br>　　骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤（MDS/MPN）是一组罕见的克隆性造血恶性肿瘤，包括慢性粒单核细胞白血病（CMML）、非典型慢性粒细胞白血病（aCML）、青少年粒单核细胞白血病（JMML）、伴有环状铁粒细胞和血小板增多症的MDS/MPN（MDS/MPN-RS-T）和不可分类的MDS/MPN（MDS/MPN-U）。其中，青少年粒单细胞白血病（JMML）是唯一的儿童发病疾病，90%以上的患者存在生殖系或体细胞突变，同时RAS/MAPK信号通路组成性激活，临床特征是骨髓发育不良和细胞减少，伴有单核细胞和粒细胞谱系的细胞增殖，造血干细胞移植是目前大多数患者的标准治疗方法。髓系祖细胞对细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-3（IL-3）产生超敏反应是该病的关键病理特征。在JMML样的MPN中最常见的基因突变是Ptpn11。<br>　　Ptpn11基因编码非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，该蛋白在细胞质、细胞核和线粒体中都广泛表达。SHP2包含两个N端串联排列的Src同源2结构域（N-SH2和C-SH2）以及一个中心酪氨酸磷酸酶（PTP）催化结构域。在非活性状态下，61位的天冬氨酸和62位的酪氨酸插入PTP结构域的催化缝隙中并封闭活性位点，保持了SHP2的自身抑制状态，抑制磷酸酶活性。SHP2是控制发育过程和造血的信号转导途径的关键组成部分，也是许多信号传导过程和途径的关键调节因子。SHP2在调节生长因子、激素、细胞因子和细胞粘附分子的生物反应中至关重要；还与多种发育障碍和癌症相关疾病有关。目前针对SHP2的相关研究主要集中在抑制剂的发现和临床疗效上，特别是SHP2变构抑制剂。我们课题组前期实验结果发现Ptpn11E76K/+功能获得性突变的小鼠会发生骨髓增殖性肿瘤相关表型，于是对野生型和突变型小鼠的骨髓细胞进行RNA测序，其中发现Fam210b基因的表达量在Ptpn11E76K/+小鼠中显著下降。<br>　　Fam210b基因是最近几年新鉴定出的位于线粒体内膜蛋白的基因。FAM210B蛋白在终末红细胞分化阶段大量上调，影响红系分化相关调控基因的表达，从而影响红系分化。最近研究发现FAM210B线粒体内膜蛋白与线粒体ATP合成酶的亚基相互作用，比如ATP5A和ATP5B；Fam210b基因敲除还降低了辅酶Q10表达水平，导致耗氧量降低，细胞转为无氧糖酵解方式代谢。因此FAM210B还影响线粒体能量代谢。Fam210b基因也与乳腺癌发生、肿瘤体内转移、低生存率和血红蛋白的珠蛋白转变有关。<br>　　综上，因为Fam210b的表达量在Ptpn11E76K/+突变小鼠中显著下降，所以我们想继续探究在会发生白血病的Ptpn11D61G/+突变小鼠骨髓细胞中Fam210b基因的表达情况，同时研究在Ptpn11D61G/+突变小鼠血细胞中特异性敲除Fam210b基因，对小鼠发展成骨髓增殖性肿瘤进程的影响。<br>　　方法：<br>　　①小鼠配繁：先用Mx1Cre/+;Fam210bF/+和Ptpn11D61G/+进行配繁，得到Ptpn11D61G/+;Mx1Cre/+;Fam210bF/+；再和Fam210bF/F进行配繁得到Ptpn11D61G/+;Mx1Cre/+;Fam210bF/F纯合子小鼠，得到的纯合子小鼠再和Fam210bF/F配繁，得到Ptpn11D61G/+;Mx1Cre/+;Fam210bF/F，Fam210bF/F和Ptpn11D61G/+;Fam210bF/F三种基因型小鼠。<br>　　②小鼠基因鉴定：当小鼠8-12天时，通过剪脚趾进行小鼠基因型鉴定。<br>　　③小鼠疾病造模：选取8周左右的同窝仔鼠，按雌雄分类进行试验。根据0.1ml/g计算PIPC药物用量，按腹腔注射方式给药。<br>　　④q-PCR：验证Ptpn11D61G/+小鼠骨髓细胞中Fam210b的表达量，观察Fam210b基因是否敲除。<br>　　⑤尾静脉采外周血：流式检测不同年龄段小鼠外周血的血细胞占比情况。<br>　　⑥流式细胞操作：从小鼠外周血、脾脏和骨髓中提取细胞，检测各系细胞占比和绝对计数情况。<br>　　结果：<br>　　1.q-PCR表明Ptpn11D61G/+小鼠的骨髓细胞中Fam210b表达量较Ptpn11+/+基因小鼠显著下降。<br>　　2.成功建立血细胞特异Fam210b敲除的Ptpn11D61G/+小鼠模型。<br>　　3.流式结果表明血细胞特异Fam210b敲除不会改变Ptpn11D61G/+小鼠外周血细胞的比例和绝对计数。<br>　　4.血细胞特异Fam210b敲除不改变Ptpn11D61G/+小鼠脾脏重量，但是减少脾脏中髓系细胞的比例。<br>　　5.Ptpn11D61G/+小鼠骨髓中长期造血干细胞比例较Ptpn11+/+小鼠显著升高；血细胞特异Fam210b敲除可能影响Ptpn11D61G/+小鼠骨髓中的长期造血干细胞。<br>　　结论：<br>　　1.Ptpn11D61G/+功能获得性突变小鼠中Fam210b表达量较Ptpn11+/+小鼠显著降低。<br>　　2.Fam210b基因影响Ptpn11D61G/+小鼠脾脏中髓系细胞的占比。<br>　　3.Ptpn11D61G/+小鼠骨髓中长期造血干细胞比例较Ptpn11+/+小鼠显著升高。