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摘要研究目的<br>　　本研究将探索nesfatin-1对于小鼠巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用以及nesfatin-1对于小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1的抗氧化抗凋亡作用，从而探讨nesfatin-1增强免疫细胞抗炎能力与增强成骨细胞抗氧化抗凋亡能力互相协同用于牙周炎（periodontitis，PD）治疗研究的应用前景。<br>　　方法<br>　　1.本实验从临床收集了牙周炎牙龈和健康牙龈各10例，苏木精/伊红染色（hematoxylinandeosin，HE）染色确定牙龈组织学炎症状态后，用实时荧光定量聚合酶链反应（quatitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR）技术检测不同分组nesfatin-1基因相对表达量，分析牙周炎发病与nesfatin-1相对基因表达量的关系，探究牙周炎与nesfatin-1之间的潜在作用关系。<br>　　2.本实验使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7细胞建立免疫细胞炎症模型。用细胞增殖-毒性试剂盒（cellcountingkit-8，CCK-8）检测不同浓度nesfsatin-1（20、40、80ng/mL）作用于RAW264.7细胞12h和24h对其细胞活力的影响，检测nesfatin-1对于RAW264.7细胞的生物相容性；运用qRT-PCR、酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）技术检测相关炎症介质肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）的相对基因表达和胞外释放含量，确定炎症模型建立成功。后续用不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理RAW264.7细胞，通过qRT-PCR和ELISA技术检测TNF-α、IL-6等炎症介质的相对基因表达和炎症因子的释放研究nesfatin-1浓度对其抗炎活性的影响，并选择抗炎效果较好的浓度来研究干预时间对其抗炎效果的影响，从而探究nesfatin-1的抗炎性能在牙周炎治疗中的应用前景。<br>　　3.本实验使用H2O2刺激MC3T3-E1细胞建立成骨细胞氧化损伤模型。通过CCK-8检测nesfatin-1对于MC3T3-E1细胞的生物相容性以及不同浓度H2O2（50、100、200、400μmol/L）作用不同时间（0.5、1、1.5h）对MC3T3-E1细胞存活率的影响，优化建立氧化损伤模型。用不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理细胞24h，以常用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）作为对照，CCK-8检测氧化损伤模型的细胞存活率；不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理后显微镜下观察细胞状态改变；用荧光显微镜观察不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理后ROS荧光强度，并用流式细胞仪定量检测活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）含量;不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理后，用相关试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；不同浓度nesfatin-1（20、40、80ng/mL）预处理后，用荧光显微镜观察细胞凋亡染色状态，并用流式细胞仪双通道检测细胞凋亡比例。<br>　　结果<br>　　1.HE染色结果显示炎症组结缔组织溶解破坏，炎细胞浸润广泛；正常组结缔组织排列较为整齐，少见破坏，炎细胞浸润局限；qRT-PCR结果显示炎症组牙龈nesfatin-1相对基因表达量高于正常组，提示牙周组织nesfatin-1含量变化可能与牙周炎发病有潜在相关性。<br>　　2.CCK-8结果显示nesfatin-1对RAW264.7细胞的生物相容性较好；显微镜观察发现经LPS刺激后，RAW264.7细胞伸出伪足，异型性增加；qRT-PCR检测显示其炎症相关基因TNF-α、IL-6的mRNA表达显著增加，ELISA检测显示其炎症介质TNF-α、IL-6释放量也有显著提升，选取1μg/mLLPS刺激12h来建立炎症模型；不同浓度nesfatin-1预处理后，qRT-PCR检测炎症相关基因TNF-α、IL-6的mRNA表达发现都有不同程度的降低，同时ELISA检测发现炎症介质TNF-α、IL-6的释放量也有不同程度的降低，表明nesfatin-1预处理具有削弱RAW264.7细胞炎症水平的作用，后续选取抗炎效果较好的80ng/mL浓度的nesfatin-1进行研究，发现其抗炎作用是较为持续的，预处理RAW264.7细胞12h以及24h均有较好的抗炎效果。<br>　　3.CCK-8检测结果显示nesfatin-1对MC3T3-E1细胞的生物相容性较好；CCK-8检测不同浓度H2O2刺激不同时间后MC3T3-E1细胞存活率，确定100μmol/L浓度的H2O2刺激MC3T3-E1细胞0.5h来建立氧化损伤模型；显微镜下观察经过nesfatin-1预处理的细胞状态相比H2O2组较好，呈高亮，形态饱满，异型性较少，贴壁较牢；CCK-8检测结果显示nesfatin-1预处理较增加了MC3T3-E1细胞氧化刺激后的存活率；流式细胞仪检测结果显示，nesfatin-1预处理较H2O2组显著降低了细胞内ROS的含量；荧光显微镜观察显示nesfatin-1预处理后ROS绿色荧光强度较H2O2组减弱；SOD检测结果显示，nesfatin-1预处理较H2O2组显著增加了细胞内SOD的含量；MDA检测结果显示，nesfatin-1预处理较H2O2组显著减少了细胞内MDA的含量；；流式细胞仪检测结果显示，nesfatin-1预处理较H2O2组减少了氧化损伤细胞的凋亡率；荧光显微镜观察显示，经过nesfatin-1预处理后橙黄色的凋亡小体的比例较H2O2组明显减少，表明nesfatin-1对MC3T3-E1具有抗氧化抗凋亡的作用。<br>　　结论<br>　　Nesfatin-1表达量与牙周炎发病具有潜在关系：牙周炎人群牙龈组织中的nesfatin-1相对基因表达量要高于健康人群；Nesfatin-1作用于RAW264.7细胞炎症模型可以有效减少其炎症介质TNF-α和IL-6的基因表达和胞外释放；Nesfatin-1作用于MC3T3-E1细胞氧化损伤模型可以通过减少ROS和MDA生成以及增加SOD含量来增强其抗氧化抗凋亡的能力；Nesfatin-1能增强免疫细胞的抗炎能力并同时提升成骨细胞抗氧化抗凋亡的能力，通过抗炎和成骨两个方面协同作用，在牙周炎治疗方面具有良好应用前景。