检索历史 清除

摘要肝纤维化是由包括酒精滥用、高脂饮食、病毒性肝炎、自身免疫疾病等在内的各种慢性刺激诱发的肝脏的损伤-修复反应。表现为肝脏炎症反应显著、细胞外基质（ECM）的生成及降解严重失衡、包括Ⅰ型胶原（COLⅠ）在内的ECM持续积累以及瘢痕淤积，破坏正常肝脏的病理构造及生理功能。慢性刺激持续，进一步恶化为肝硬化及肝癌，造成不可逆转的后果。肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSCs）是肝脏非实质细胞的重要一员，活化的HSCs产生大量胶原，作为肝纤维化发生发展的中心环节，成为肝纤维化机制研究的常规细胞。BRD4是溴域与端外结构域（Bromodomainandextraterminaldomain，BET）家族中的一员，因其具有独特的溴域结构，常作为组蛋白乙酰化阅读蛋白，或参与组建及诱导加成增强子和超级增强子，参与机体细胞的表观遗传修饰，在转录、复制和DNA修复中起重要作用。它也结合非组蛋白、DNA和RNA，有助于细胞发育、组织生长和各种生理过程。此外，BRD4与多种疾病有关，包括癌症、病毒感染、炎症和神经系统疾病等。<br>　　目的:本文主要探究BRD4在体内外的肝纤维化形成及逆转模型中的功能和机制，证实了抑制BRD4对肝纤维化治疗及帮助恢复的可能性。<br>　　方法与结果:我们建立了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型以及自然恢复的逆转模型，通过病理切片、免疫组学、血清学指标验证模型成功与否，然后利用Westernblot、qRT-PCR检测发现，BRD4在纤维化小鼠肝脏中表达升高，逆转小鼠中略有下降，与纤维化相关指标α-SMA和COLⅠ的表达变化一致。利用LX2细胞，我们分别建立TGFβ诱导的活化细胞、成脂混合物（MDI）诱导的失活态细胞，模拟体外肝纤维化的形成及逆转模型，利用免疫荧光及Westernblot检验纤维化指标及BRD4的表达，结果与体内相似。<br>　　为探究BRD4在纤维化发展中的具体功能，我们使用梯度浓度的BET小分子抑制剂JQ1和iBET151分别处理TGFβ活化的LX2细胞，构建siRNA和过表达质粒，干扰LX2细胞中BRD4的表达。结果表明，BET小分子抑制剂及siBRD4明显抑制TGFβ诱导的α-SMA和COLⅠ的表达，相反，pcDNA3.1载体过表达BRD4后促进了LX2细胞中α-SMA和COLⅠ的表达。在TGFβ活化的LX2细胞中，siRNA抑制BRD4后，流式细胞术检测活化细胞的凋亡率增加，Westernblot检测凋亡相关蛋白比Bax/Bcl2和Cleaved-Caspase3/Caspase3升高；CCK8及流式细胞术检测细胞增殖活力减弱，Westernblot检测到周期相关蛋白C-myc和CyclinD1表达降低。在MDI诱导失活的LX2细胞中，pcDNA3.1载体过表达BRD4后，流式细胞术、CCK8及Westernblot检测结果显示，失活态细胞凋亡水平降低，增殖能力提高。在体内，我们利用腺相关病毒AAV8介导的BRD4敲低处理CCl4诱导的纤维化小鼠，利用病理切片、血清学水平及分子水平验证BRD4敲低效率及小鼠纤维化程度，结果显示，BRD4敲低后，小鼠肝脏的炎症及纤维化程度明显减轻，纤维化相关指标α-SMA和COLⅠ表达降低。<br>　　为研究BRD4发挥功能的具体机制，我们利用JQ1及siRNA干扰BRD4表达后，利用Westernblot和qRT-PCR检测活化的LX2细胞中PLK1的表达明显降低。我们通过UCSC基因组浏览器数据库观察到PLK1转录起始位点上丰富的H3K27ac信号，Westernblot检测活化的LX2细胞中H3K27ac的表达升高。利用小分子抑制剂C646抑制H3K27ac表达后，Westernblot检测活化的LX2细胞中纤维化相关指标及PLK1的表达降低。在活化的LX2细胞中，对H3K27ac上游的组蛋白乙酰转移酶P300进行敲低处理后，检测到PLK1、α-SMA和COLⅠ的mRNA及蛋白表达受到抑制。在活化的LX2细胞中，ChIP和Co-IP实验证明，与阴性对照相比，siRNA介导P300敲低后，PLK1启动子区的H3K27ac富集减少，且H3K27ac与BRD4的相互作用也减少。最后，同时敲低P300且过表达BRD4后，检测活化的LX2细胞中siP300能够部分抑制BRD4过表达产生的PLK1、α-SMA和COLⅠ的表达升高作用。以上结果揭示了BRD4发挥促纤维化功能的表观遗传学机制。<br>　　结论:BRD4发挥其表观遗传调控活性，通过结合PLK1启动子区乙酰化的组蛋白，调节P300/H3K27ac/PLK1轴，参与肝纤维化中的星状细胞活化、增殖、凋亡及失活过程，为肝纤维化的研究治疗提供新靶向。