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摘要酒精相关性肝纤维化（alcohol-relatedliverfibrosis,ALF）是酒精相关性肝病(ALD)的重要病理过程，其特点为细胞外基质（extracellularmatrixs,ECM）的大量沉积。肝星状细胞（hepaticstellatecells,HSCs）的活化在肝纤维化的进展中发挥至关重要的作用，抑制其活化能够有效地降低ECM的合成和沉积，减轻肝纤维化。CD73是一种膜结合糖蛋白，能将细胞外的AMP去磷酸化，从而生成腺苷，腺苷及其受体能影响肝脏炎症，纤维化和癌症的发展，CD73也参与肝脏炎症和肝癌进展，并且参与细胞自噬，且有研究显示HSCs自噬增加能促进其活化。本课题使用CD73敲除小鼠和大鼠肝星状细胞（HSC-T6）为研究对象，发现敲除CD73能够减轻小鼠ALF，下调肝脏自噬水平，自噬抑制剂3-MA能够减少乙醛对HSC-T6细胞的活化，此外，研究显示CD73调控HSC-T6细胞自噬，进而促进其活化，本课题阐述了CD73对ALF和HSC活化中的作用和机制，为治疗酒精相关性肝纤维化提供了新方向。<br>　　目的：<br>　　本研究主要探究CD73对EtOH+CCl4诱导的小鼠酒精相关性肝纤维化以及乙醛刺激的HSC-T6细胞自噬的作用及可能的分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.小鼠酒精相关性肝纤维化组织和乙醛激活的HSC-T6细胞中CD73和自噬水平的变化。<br>　　体内实验：使用普通8-10周大的雄性C57BL/6小鼠，按照随机对照原则均分成对照组（control）和模型组（EtOH+CCl4）。EtOH+CCl4组小鼠给予8周酒精液体饲料喂养，同时用酒精灌胃，每周2次，最后2周腹腔注射CCl4建立小鼠ALF模型。造模周期的最后一天，模型组给予酒精灌胃，9h后称取小鼠体重，眼球取血，收集肝脏组织并称重。计算小鼠肝指数（肝重/体重），肝脏损伤情况通过测定小鼠血清ALT和AST含量以及HE染色来进行评价；肝脏中胶原沉积状况利用Masson染色来观察；Westernblot和qRT-PCR检测CD73和纤维化指标的变化。<br>　　体外实验：首先通过CCK-8检测不同浓度的乙醛对HSC-T6活力的影响，利用Westernblot和qRT-PCR来确定乙醛诱导HSC-T6细胞活化的适宜浓度和时间。此外，采用Westernblot，qRT-PCR和IF来检测细胞中CD73，α-SMA，TGF-β1和Collagen1以及自噬相关指标LC3，Beclin1，ATG5和p62的表达变化。<br>　　2.3-MA能减少HSC-T6细胞的活化<br>　　HSC-T6细胞先用自噬抑制剂3-MA处理6h，随后用乙醛刺激48h。Westernblot和qRT-PCR检测细胞中自噬指标LC3，Beclin1，ATG5以及α-SMA，TGF-β1和Collagen1的表达变化，同时使用IF检测细胞中LC3和ATG5荧光强度。<br>　　3.CD73通过促进HSCs自噬加重酒精相关性肝纤维化<br>　　使用野生型（WT）和CD73敲除（CD73-/-）的C57BL/6小鼠（8-10周龄，雄性）建立ALF模型。将小鼠随机分成：野生型对照组[WT(Control)]，野生型模型组[WT(EtOH+CCl4)]，CD73-/-对照组[CD73-/-(Control)]，CD73-/-模型组[CD73-/-(EtOH+CCl4)]。通过HE染色，测定血清ALT和AST水平来检测CD73敲除对肝损伤的影响；采用SiriusRed染色法来检测CD73敲除后肝脏胶原沉积情况；Westernblot和qRT-PCR检测α-SMA及Collagen1表达；IHC和qRT-PCR检测肝脏自噬相关指标的表达。<br>　　体外，在HSC-T6细胞中沉默或者过表达CD73，使用Westernblot，qRT-PCR和IF等方法来检测细胞中α-SMA，TGF-β1和Collagen1含量，自噬水平以及P-AMPK，P-AKT，P-mTOR蛋白表达情况。<br>　　结果：<br>　　1.与Control组小鼠相比，EtOH+CCl4组小鼠肝指数变大，血清生化指标ALT和AST含量显著增加，肝脏中有炎症细胞浸润且胶原沉积增多。乙醛活化的HSC-T6细胞中α-SMA，Collagen1以及CD73表达均增加，自噬指标表达也增加。<br>　　2.与Acetaldehyde组细胞相比，使用3-MA（2mM）能够减少Beclin1和ATG5蛋白的表达，减弱细胞内LC3和ATG5的荧光强度，同时能明显降低细胞内α-SMA，TGF-β1和Collgen1表达水平。<br>　　3.与[WT(EtOH+CCl4)]组的小鼠相比，[CD73-/-(EtOH+CCl4)]组小鼠肝组织中α-SMA和Collagen1表达明显减少，炎症细胞浸润减少，肝损伤减轻，肝脏胶原沉积减少。此外，敲除CD73降低肝组织中自噬相关指标的表达。<br>　　体外沉默CD73能够明显降低乙醛刺激的HSC-T6细胞中α-SMA，TGF-β1和Collagen1的含量，降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例，减弱细胞内LC3和ATG5的荧光强度，降低ATG5和Beclin1蛋白水平，但使p62蛋白表达增加；此外，沉默CD73下调P-AMPK蛋白，而上调P-AKT和P-mTOR蛋白。而过表达CD73则出现与沉默CD73相反的结果。<br>　　结论：<br>　　(1)敲除CD73可以下调HSCs自噬，减轻ALF；(2)CD73可能通过AMPK/AKT/mTOR通路调控HSCs自噬，从而影响HSCs活化。