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NME2通过调控4EBP1磷酸化抑制自噬促进HCC细胞增殖的机制研究

摘要背景:肝癌仍然是一个全球性的健康挑战,其中肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)作为全球癌症相关死亡率的第四大原因,约占肝癌比例的90%,各种因素,包括黄曲霉素B1暴露、HBV和HCV感染、AALD、肥胖、NAFLD和血色病,以及遗传疾病(如肿瘤抑制因子或者癌症基因突变),均可促进HCC的发生。在我国,虽然HCC的治疗更加多样化和个体化,但5年生存率仍难以提高。大多数HCC确诊时已属晚期,因此需要阐明HCC发生发展的重要分子机制和判断HCC的预后,从而制定HCC防治的新策略。NME2(non-metastaticcells2),也被称为NM23-H2或NDPKB,位于染色体17q21上,编码核苷二磷酸激酶B亚基。NME2是一种参与基因转录调控的转移相关蛋白,在恶性肿瘤中存在差异表达,可能参与了癌症的病理过程。但NME2在HCC中的报道较少,我们前期通过生物信息学挖掘得出NME2在HCC中高表达,并且NME2的表达与自噬的调控有关。为了进一步阐明NME2对HCC恶性行为的影响和机制,本研究以NME2为出发点,探究NME2在HCC中所发挥的作用及其作用机制。<br>  目的:(1)明确NME2在HCC患者中的表达以及与临床预后的关系。(2)体内体外验证NME2在HCC中的作用。(3)探究NME2对HCC自噬的影响及其作用机制。<br>  方法:(1)免疫组化染色评估组织芯片中96例HCC患者癌和癌旁NME2表达量。完善96例HCC患者随访数据。(2)通过小干扰RNA和慢病毒转染构建NME2敲除肝癌细胞株Huh7和HepG2。Westernblot验证NME2成功敲除后,通过细胞克隆和MTT增殖验证NME2敲除对HCC细胞增殖的影响。(3)构建NME2敲除和过表达的Huh7细胞系,用于裸鼠皮下肿瘤形成。15只健康的裸鼠随机分为3组:对照组、NME2敲除组和NME2过表达组,每组5只。观察NME2在体内对肝癌增殖的影响。(4)Westernblot检测敲除NME2后Huh7细胞中LC3B、Beclin-1、P62、ATG5的变化。(5)利用激光共聚焦显微镜和透射电镜观察NME2敲除对HCC细胞自噬体和自溶酶体的变化。(6)采用免疫组化方法验证裸鼠肿瘤组织中NME2与LC3B蛋白的相关性。(7)体外验证NME2对自噬相关通路蛋白的影响,并进行反向验证。<br>  结果:(1)NME2在HCC患者中相对高表达,与患者5年生存率呈负相关。(2)在Huh7和HepG2中敲除NME2可以抑制HCC细胞的增殖与克隆。(3)NME2在体内裸鼠移植瘤实验中可以促进肿瘤的增殖(4)NME2敲低可以上调Huh7细胞LC3B(Ⅰ和Ⅱ)蛋白表达,氯喹(CQ)联合NME2敲低比单独NME2敲低诱导更多LC3B(Ⅰ和Ⅱ)蛋白表达。(5)在激光共聚焦显微镜和透射电镜下发现,与对照组相比,敲除NME2可使Huh7细胞自噬体和自噬溶酶体数量增加。(6)CQ可以逆转NME2敲低对Huh7细胞增殖的影响。(7)NME2过表达的细胞和裸鼠肿瘤组织中LC3B蛋白表达降低。(8)NME2可以调控4EBP1磷酸化水平,并且4EBP1Thr37/46位点的突变抵消了NME2敲除对HCC细胞自噬激活和抑制增殖的能力。<br>  结论:(1)NME2在HCC中高表达,与患者预后呈负相关,并且具有促进肿瘤增殖的功能。(2)NME2可以通过激活自噬促进HCC细胞增殖。(3)P-4EBP1介导了NME2对HCC自噬和增殖的调控。

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