检索历史 清除

摘要背景<br>　　肺癌是当今世界发病率及死亡率最高的肿瘤之一。肺腺癌是肺癌中发病率最高的的一种亚型，占比超过50%。肺腺癌临床症状不明显，诊断时大多为中晚期，常伴有远处转移，患者预后较差。近年来，肺腺癌的治疗方法与手段不断改进，但患者的临床生存仍面临巨大挑战。因此，建立肺腺癌生物学模型以评估患者预后以及优化临床用药，并对肺腺癌的发病机制尤其是肿瘤微环境相关的致病基因寻找与鉴定极为重要。<br>　　目的<br>　　本研究使用癌症基因组图谱在线数据库TCGA（TheCancerGenomeAtlas）及GEO（GeneExpressionOmnibus）中肺腺癌数据集进行生物信息学分析，筛选出的基因通过体外细胞实验进行验证，进而构建肺腺癌的临床预后模型及探讨CCT3（chaperonincontainingTCP1subunit3）这种分子伴侣蛋白在肺腺癌肿瘤微环境塑造中的作用。<br>　　方法<br>　　（1）从TCGA数据库中选择535例肺腺癌和59例对照样本，联合GSE30219数据集（包含307例肺癌数据）筛选免疫相关基因（IRGs），并采用GSE68465，GSE101929，GSE37745和GSE83845合并数据集进行验证。基于IRGs建立一个风险模型用于肺腺癌患者的风险评估。采用基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）探究与风险模型相关的生物学过程（Biologicalprocess，BP）和信号通路（Signalingpathway，SP）。采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测IRGs的mRNA表达水平<br>　　（2）利用UALCAN数据库、人类蛋白质图谱（HPA）和TCGA数据分析CCT3在肺腺癌中的表达。采用Wilcoxon秩和检验和回归模型分析肺腺癌患者临床病理特征与CCT3表达的关系。采用Cox回归模型、Kaplan-Meier法和诺莫图预测模型评估CCT3对肺腺癌患者预后的预测价值。其次，我们通过GeneMANIA和String数据库寻找与CCT3Hub基因，并通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）确定CCT3与浸润的免疫细胞相关性。基因集富集分析（GSEA）探究CCT3相关信号通路。最后，通过小干扰RNA（siRNA）敲低CCT3表达，验证CCT3对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的作用。<br>　　结果<br>　　（1）筛选出两个与浆细胞高度相关的免疫相关基因，即嘌呤能受体P2RX1和浦肯野细胞蛋白4（PCP4）。RT-qPCR结果表明P2RX1和PCP4在浆细胞瘤细胞RPMI-8226中高表达，而在肺腺癌细胞A549，H3255和HCC827中未见表达。基于P2RX1和PCP4建立一个肺腺癌风险模型，其风险得分与肺腺癌记忆性B细胞（Plt;0.05）、浆细胞（Plt;0.001）、CD8+T细胞（Plt;0.05）和活化的CD4+记忆性T细胞（Plt;0.05）等免疫细胞浸润呈负相关。Kaplan-Meier分析显示，高风险组的生存率显著低于低风险组（TCGA训练集P=0.004；GEO验证集P=0.023）。并且，高风险组对PD-L1/PD-1阻断治疗的应答率显著低于低风险组（P=0.012）。GSVA和GSEA-GO分析结果表明，Toll样受体（TLR）、T细胞受体（TCR）、Nod样受体（NLR）、JAK-STAT通路、Hedgehog、GnRH(Gonadotropin-releasinghormone)、FcεRI、趋化因子、钙离子受体、B细胞受体等信号通路富集于低风险评组，相反，较高的风险得分与Wnt通路、PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)、P53、mTOR通路、胰岛素和ErbB等信号通路相关。<br>　　（2）生信分析结果表明，CCT3在肺腺癌组织中mRNA和蛋白水平均显著上调（P均lt;0.001）。CCT3过表达与肺腺癌患者的性别、吸烟、T分期、N分期等临床病理特征及不良预后相关。GeneMANIA和String数据库发现一组与CCT3相关的基因，这些基因与细胞骨架微丝的维持、DNA修复和甲基化相关的蛋白质的组装和稳定有关。ssGSEA分析显示，CCT3与肿瘤微环境中浸润的Th2细胞呈正相关(r=0.442，plt;0.01)，与肥大细胞(r=-0.49，plt;0.01)和未成熟树突状细胞(r=-0.401，plt;0.001)呈负相关。基于GSEA方法的通路功能分析显示，细胞周期、蛋白输出、蛋白酶体和核糖体等通路在CCT3高表达组中富集，而JAK/STAT、B细胞受体通路（BCR）、T细胞受体（BCR）和Toll样受体（TLR）等通路在CCT3低表达组中富集。此外，CCT3敲低显著抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡。<br>　　结论<br>　　（1）基于P2RX1和PCP4构建的免疫相关模型可用于预测肺腺癌预后及PD-L1/PD-1阻断治疗疗效。<br>　　（2）CCT3是形成免疫抑制性肿瘤微环境的调节因子，其异常表达与肺腺癌临床病理特征以及肿瘤微环境基因与免疫学特征紧密相关。