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摘要目的：<br>　　新型冠状病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2）隶属于冠状病毒，是一种有具有包膜包裹的正义单链RNA病毒，可引起新型冠状病毒肺炎（CoronaVirusDisease2019，COVID-19）。本研究通过对SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp10和Nsp16的基因序列进行克隆，通过原核表达载体系统对两种蛋白进行表达，并成功制备了Nsp10和Nsp16和Nsp10/Nsp16融合蛋白，并通过体外转录的方法对RNA进行加帽，获得Nsp10和Nsp16功能检测所用的底物。<br>　　方法：<br>　　(1)根据Genebank公布的SARS-CoV-2冠状病毒非结构蛋白Nsp10（NCBI：YP_009725306.1）和Nsp16（NCBI：YP_009725311.1）的基因序列设计引物，用PCR的方法把Nsp10和Nsp16基因从SARS-CoV-2冠状病毒的cDNA片段中扩增出来，将目标基因融合His基因标签后利用限制性内切酶双酶切的方法连接到原核表达载体PET15b和PET30a中，构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切反应进行初步鉴定，并将初步鉴定后的质粒进行测序。如果克隆的Nsp10和Nsp16基因序列与发表基因完全一致，说明成功构建了原核表达载体。<br>　　(2)重组质粒PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16的优化诱导表达。将成功构建的原核表达重组质粒PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，经菌液PCR鉴定后，通过对时间、IPTG浓度诱导优化后进行蛋白表达。<br>　　(3)利用SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹法（WesternBlot，Wb）验证目的蛋白是否在成功表达。通过SDS-PAGE电泳和Wb验证Nsp10和Nsp16蛋白质是否以可溶形式存在，为得到纯度较高的Nsp10和Nsp16蛋白质，对非结构蛋白Nsp10和Nsp16的表达和纯化条件进行了优化，利用镍层析柱对非结构蛋白Nsp10、Nsp16和Nsp10/Nsp16融合蛋白进行纯化。<br>　　(4)对RNA加帽底物进行制备。通过KOD酶对SARS-CoV-2冠状病毒进行UTR的cDNA片段的克隆，利用体外转录试剂盒进行体外转录获得RNA，通过CappedRNASynthesis加帽系统对RNA进行加帽，以得到RNA加帽底物。<br>　　结果：<br>　　(1)将SARS-CoV-2冠状病毒非结构蛋白Nsp10的复制子和PET15b质粒通过限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切连接构建，命名重组质粒为PET15b-Nsp10。将SARS-CoV-2冠状病毒非结构蛋白Nsp16的复制子和PET30a质粒通过限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切连接构建，命名重组质粒为PET30a-Nsp16。测序结果显示成功构建了PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16重组质粒。<br>　　(2)将重组质粒PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16通过蓝白筛选后将克隆正确测序的PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16表达质粒转化到大肠杆菌中，种在带有抗性的LB培养板上，37℃下培养12-14小时后，挑取单克隆菌株通过优化培养条件，选择0.1mMIPTG培养16h将PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16重组质粒进行大量目的蛋白的表达。<br>　　(3)通过SDS-PAGE电泳和Wb发现Nsp10和Nsp16蛋白质大量表达并以可溶形式存在，对非结构蛋白Nsp10和Nsp16进行了优化纯化条件并通过镍层析柱进行纯化，获得了纯化后的Nsp10和Nsp16蛋白质，并将菌体混合进行Nsp10/Nsp16融合蛋白的纯化。<br>　　(4)通过体外转录的方法到了SARS-CoV-2冠状病毒的UTR的RNA，通过CappedRNASynthesis加帽系统对RNA进行加帽，以得到RNA作用底物。<br>　　结论：<br>　　(1)成功构建了SARS-CoV-2冠状病毒Nsp10和Nsp16表达载体PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16。<br>　　(2)成功表达了PET15b-Nsp10和PET30a-Nsp16重组质粒，成功优化培养条件并大量表达以可溶形式存在的Nsp10和Nsp16蛋白。<br>　　(3)成功通过镍层析柱纯化了Nsp10和Nsp16蛋白和Nsp10/Nsp16融合蛋白，为体外功能的研究提供了基础。<br>　　(4)成功通过体外转录的方法得到了底物RNA进行加帽，为甲基化功能检测提供了底物。