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摘要研究背景和目的：<br>　　对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP），是临床上广泛使用的解热镇痛药之一，尽管治疗剂量下相对安全，但过量使用会导致急性肝损伤甚至急性肝衰竭，APAP已成为全世界范围内急性肝衰竭的主要病因。目前APAP引起肝损伤的机制尚不完全清楚。铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡方式，近期研究报道铁死亡参与APAP诱导的肝损伤，但具体机制不明。因此本研究拟评估线粒体活性氧（mitochondrialROS，mtROS）在APAP诱导肝细胞铁死亡中的作用，观察线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对APAP诱导肝细胞铁死亡的保护作用。<br>　　研究方法：<br>　　一、动物实验：实验1：为建立APAP诱导的急性肝损伤模型：40只ICR雄性小鼠统一禁食后腹腔注射APAP(300mg/kg)，分别在不同的时点（2、6、24h）取材，检测肝组织GSH、MDA及4-HNE水平，检测肝组织铁死亡特异性标记物ACSL4蛋白及ptgs2mRNA水平，TUNEL法检测肝细胞死亡，透射电镜观察肝细胞超微结构，检测血清中ALT、AST水平，观察肝组织病理学变化。实验2：为探索铁死亡在APAP诱导急性肝损伤中的作用：本研究运用了铁死亡特异性抑制剂Fer-1，60只小鼠随机分为四组：Ctrl组，Fer-1组，APAP组，APAP+Fer-1组。在APAP组和APAP+Fer-1组，小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)；在Fer-1组和APAP+Fer-1组，小鼠预前1h腹腔注射Fer-1(5mg/kg)。所有小鼠在APAP给药后2h或6h分别处死，留取肝脏和血清待测。实验3：为探索MitoQ对APAP诱导肝细胞铁死亡的保护作用：60只小鼠随机分为四组：Ctrl组，MitoQ组，APAP组，APAP+MitoQ组。在APAP组和APAP+MitoQ组，小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)；在MitoQ组和APAP+MitoQ组，小鼠预前1h腹腔注射MitoQ(4mg/kg)。所有小鼠在APAP给药后2h或6h分别处死，留取肝脏和血清待测。<br>　　实验4：为评估MitoQ对小鼠生存率的影响：20只雄性小鼠随机分为2组：APAP组，APAP+MitoQ组：在APAP组：小鼠腹腔注射APAP(500mg/kg)；在APAP+MitoQ组：小鼠腹腔注射APAP(500mg/kg)预前1h腹腔注射MitoQ(4mg/kg)，观察并记录48h小鼠的生存情况。<br>　　二、细胞实验：实验1：为建立APAP诱导脂质过氧化及线粒体功能障碍的时效关系：AML-12细胞与APAP（25mM）分别共培养3、6、12h，检测氧化脂质水平，检测线粒体功能（线粒体膜电位、氧化磷酸化复合体蛋白水平、ATP含量）及mtROS变化。实验2：为探索铁死亡在APAP诱导肝细胞死亡中的作用：AML-12细胞分别与Fer-1、DFO（铁螯合剂）及zVAD-fmk(凋亡抑制剂)预处理孵育1h，再与APAP（25mM）共培养24h，分别观察不同抑制剂对肝细胞死亡的影响。实验3：为观察MitoQ对APAP诱导肝细胞铁死亡的保护作用：将AML-12细胞与MitoQ(180nM)预处理孵育1h，再与APAP（25mM）共孵育12h或24h，检测线粒体功能、mtROS、氧化脂质及肝细胞死亡的变化。实验4：为探讨MitoQ的保护机制：AML-12细胞分别转染FSP1或GPX4SiRNA后与MitoQ(90nM)预处理孵育1h，再与APAP（25mM）共孵育12或24h，检测氧化脂质及肝细胞死亡的变化。<br>　　研究结果：<br>　　1.APAP诱导肝损伤后早期即出现肝细胞死亡及铁死亡特征的线粒体体积缩小：小鼠在APAP给药后2h即出现肝细胞死亡，并在6h持续增加，24h达到高峰。铁死亡特征的超微结构损伤在本模型中主要表现为线粒体缩小，在APAP给药后2h即出现，并持续至24h。2.APAP在体内、体外均可快速诱导脂质过氧化：小鼠肝组织GSH水平在APAP给药后2h即出现耗竭，脂质过氧化产物MDA和4-HNE水平在APAP给药后2h和6h升高。ACSL4蛋白水平在APAP给药后2h开始升高，持续增加至24h。肝组织ptgs2mRNA水平在APAP给药后6h开始升高，并持续至24h。细胞实验观察到APAP染毒AML-12细胞3h后即出现氧化脂质增加，并持续增加至12h。3.铁死亡发生在APAP诱导肝损伤的早期阶段:细胞实验结果表明，Fer-1和DFO可以部分减轻APAP诱导的AML-12细胞死亡，而zVAD-fmk无效。动物实验进一步显示，Fer-1预处理部分恢复小鼠肝组织GSH水平，明显降低脂质过氧化产物MDA、4-HNE水平，降低铁死亡标记物ptgs2mRNA，改善肝细胞死亡及线粒体超微结构损伤，最终明显减轻急性肝损伤。4.APAP诱导AML-12细胞mtROS快速增加：APAP给药后3h即出现线粒体膜电位降低，并持续降低至12h；同时APAP可诱导OXPHOS复合体5个亚基蛋白水平降低，从给药后3h开始，并持续降低至12h；相应的，胞内ATP含量从APAP给药后3h降低，并持续降低至12h；而mtROS从APAP染毒后3h开始升高，并持续升高至12h。5.MitoQ抑制APAP诱导的AML-12细胞脂质过氧化及铁死亡：MitoQ预处理部分改善APAP诱导后的AML-12线粒体膜电位降低，部分恢复细胞内ATP含量，部分清扫mtROS，几乎逆转了APAP诱导的脂质过氧化，最终明显减轻肝细胞铁死亡。6.MitoQ保护APAP诱导的小鼠肝细胞铁死亡及急性肝损伤：MitoQ预处理部分恢复小鼠肝组织GSH水平，明显降低脂质过氧化产物MDA、4-HNE水平，降低铁死亡标记物ptgs2mRNA，改善肝细胞死亡及线粒体超微结构损伤，明显减轻急性肝损伤，并提高了APAP暴露后小鼠的生存率。7.FSP1沉默减弱MitoQ对APAP诱导的脂质过氧化及肝细胞铁死亡的保护作用：FSP1沉默对APAP诱导的氧化脂质几乎没有影响，但明显增加了APAP诱导的肝细胞铁死亡；同时FSP1沉默减弱了MitoQ对APAP诱导的脂质过氧化及肝细胞铁死亡。8.GPX4沉默不影响MitoQ对APAP诱导的脂质过氧化及肝细胞铁死亡的保护作用：GPX4沉默虽然明显增加了APAP诱导的脂质过氧化及肝细胞铁死亡，但不影响MitoQ对APAP诱导的脂质过氧化及肝细胞铁死亡的保护作用。<br>　　研究结论：<br>　　铁死亡发生在APAP诱导肝损伤的早期阶段；mtROS可能触发了APAP诱导的肝细胞铁死亡；线粒体靶向抗氧化剂MitoQ以部分FSP1依赖的方式保护APAP诱导的肝细胞铁死亡。