检索历史 清除

摘要第一部分：临床研究发现唾液及血液中的褪黑素具有昼夜节律性，癫痫患者癫痫发作频率及严重程度受到不同时段褪黑素分泌水平的影响。<br>　　目的：通过动态监测不同时段癫痫患者及正常健康对照组血清及唾液中褪黑素（MEL，melatonin）含量的变化，探讨不同时段MEL分泌的特点，此外通过视频脑电监测（EEG）不同时段癫痫患者脑电图的改变，探讨癫痫患者癫痫发作频率及严重程度与MEL昼夜节律之间的相关性。<br>　　方法：通过采集颞叶癫痫患者和正常健康对照组不同时段的血液及唾液样本，使用ELISA检测方法对不同时段的血清和唾液样本中MEL水平进行实时动态的跟踪监测，通过检测癫痫患者、健康对照人群中不同时段的血清以及唾液样本中MEL含量变化并对两者进行比较。此外，通过视频脑电图监测的方式来记录癫痫患者不同时间段癫痫发作的频率以及严重程度。<br>　　结果：临床上癫痫患者发病频率及严重程度与不同时段褪黑素（MEL）分泌量的改变明显相关，通过检测不同时段MEL水平含量的变化，研究发现白天MEL含量分泌呈逐渐降低趋势，数据显示午间时段MEL分泌量显著减少，并且白天不同时段MEL分泌量均低，但是到夜间，MEL分泌含量呈逐渐增加趋势，凌晨时段MEL分泌量最多，在监测不同时段MEL分泌量变化的同时完善视频脑电图记录，结果表明：癫痫患者癫痫发作频率及严重程度受到不同时段MEL分泌量大小的影响。<br>　　结论：<br>　　1、临床研究中发现褪黑素分泌特点具有昼夜节律性。<br>　　2、褪黑素分泌水平显著影响癫痫患者发作频率及严重程度。<br>　　第二部分：动物及细胞学实验研究表明褪黑素主要通过RhoA/Rock通路介导小胶质细胞极化在颞叶癫痫炎症反应发挥作用。<br>　　目的：动物癫痫研究中发现小鼠癫痫发作过程中脑内不同类型的小胶质细胞被激活。此外，发现动物体内具有调节昼夜节律的褪黑素（MEL,melatonin）可以改变小胶质细胞活化的方向。然而，MEL通过何种机制通路在癫痫动物模型中发挥作用目前仍不确定。本次研究在临床研究的基础上，明确MEL对海人酸（KA,Kainicacid）诱导的癫痫持续状态小鼠模型的抗癫痫治疗以及癫痫后脑保护作用，并探讨MEL治疗癫痫疾病潜在的作用机制。<br>　　方法：动物水平上主要分为4组:CON组、MEL组、KA组和KA+MEL治疗组，癫痫造模方法通过立体定向注射KA（600nl，0.5ug/ml）到小鼠左侧海马区域诱发小鼠癫痫发作。假手术组（MEL组）是在同一部位注射等量的生理盐水，总体治疗方案是褪黑素（MEL，10mg/kg）按照不同时间疗程（疗程分别为7d和15d）腹腔注射进行治疗，MEL治疗7天后提取不同组别的海马组织送检分析，蛋白组学方法分析出MEL治疗癫痫疾病的主要机制通路。通过病理组织学染色（Hamp;E、NISSL和TUNEL染色），观察皮层（Cortex）、海马CA1区、海马CA2区域神经元细胞存活状态，IHC、IF和RT-qPCR检测小胶质细胞极化的方向和表型变化，WB检测相关通路上下游蛋白的表达。通过频脑电图（EEG）实时记录癫痫发作频率、持续时间以及发作等级，水迷宫实验（MWM）评估小鼠学习、记忆以及认知功能改变。<br>　　细胞水平上分为6组，CON、DMSO组、LPS组、LPS+MEL组、LPS+MEL+ROCK2过表达组（ROCK-OE）、LPS+MEL+ROCK2敲低组（ROCK-KD)，通过RT-qPCR、IF、FCM检测不同组别中BV2细胞极化状态，WB检测RhoA相关通路中蛋白表达量大小，并通过慢病毒（LV,Lentivirus）转染得到ROCK-KD及ROCK-OE稳转细胞系，再次通过上述实验方法检测CON组、ROCK-OE组以及ROCK-KD组这3组中BV2细胞极化状况,以及通过WB检测RhoA相关通路上下游蛋白的表达量，此外，研究中使用BV2细胞条件培养基对HT22细胞进行处理。<br>　　结果：在动物模型中，海人酸（KA）诱导的癫痫小鼠脑组织中M1型小胶质细胞促炎表型标志物表达增加，M2型小胶质细胞抗炎标志物分泌减少，褪黑素（MEL）治疗后，M1型抗炎表型标记物分泌减少，M2抗炎表型标记物表达增加，研究结果表明MEL通过改变癫痫小鼠脑内小胶质细胞活化的方向，降低癫痫后脑内炎症反应进展，起到癫痫后脑保护作用进而降低癫痫发作。细胞水平上，脂多糖(LPS)刺激BV2细胞模拟体内炎症反应环境，MEL显著抑制炎性BV2细胞向M1促炎方向极化，促进BV2细胞向M2抗炎方向极化，通过慢病毒转染得到过表达（ROCK-OE）/敲低（ROCK-KD）稳转细胞系，研究结果发现在ROCK-OE组中MEL治疗效果相比较CON组和ROCK-KD有所下降，在ROCK-KD组中MEL治疗效果较CON组和ROCK-OE显著增加，此外，研究结果表明MEL通过抑制BV2细胞分泌促炎因子进而降低HT22细胞的死亡率。<br>　　结论：以上动物及细胞实验结果均证明MEL通过负向调控RHOA/ROCK2信号通路在治疗颞叶癫痫动物模型疾病中发挥重要作用。