检索历史 清除

摘要研究背景与目的：<br>　　汞（Hg）及其化合物是全球范围内的一种环境污染物和有毒物质，具有持久性、高度生物积累性，可引起生物体一系列生化改变、氧化应激、炎症以及自噬等，直接或间接地引发动物和人的各种疾病。Hg能够穿越血脑屏障对大脑造成损伤，被称为最具神经毒性的重金属之一，其中氯化汞（Mercuricchloride，HgCl2）脂溶性虽较低，但依旧能穿过血脑屏障在神经组织中积累并造成损伤。葛根素（Puerarin,Pue）是从葛根中分离提取得到的异黄酮类化合物，具有抗炎、调节自噬、抗氧化、抗凋亡等功能，但是水溶性较差，口服给药后体内吸收极差，生物利用度低。因此，为了解决Pue口服生物利用度低的问题，本研究拟以PLGA为载体材料，制备Pue-PLGA纳米粒（Pue-PLGA-nps）给药系统，进行制剂学评价，并通过灌胃的方式构建HgCl2中毒小鼠脑损伤模型，探讨Pue及Pue-PLGA-nps对HgCl2诱导的脑损伤的生物学效应，为Pue及Pue-PLGA-nps在临床上的广泛应用，HgCl2中毒的防治措施提供理论基础。<br>　　材料与方法：<br>　　1.根据本课题组前期响应面实验得出的最优物料比制备了Pue-PLGA-nps，从粒径、zeta电位，载药量和包封率，扫描电镜下形态方面来进行制剂学评价，通过透析法对Pue-PLGA-nps的体外释放特性进行考察，并以SPF级KM小鼠为动物模型，应用HPLC对Pue-PLGA-nps的体内代谢特性进行评价。<br>　　2.通过灌胃的方式建立HgCl2中毒小鼠脑损伤模型，使用Pue和Pue-PLGA-nps进行干预。小鼠喂养7天后被分成5组：生理盐水组（NS）、HgCl2组（4mg/kg）、Pue-PLGA-nps组（50mg/kg）、HgCl2+Pue组（4mg/kg+30mg/kg）、HgCl2+Pue-PLGA-nps组（4mg/kg+50mg/kg），试验期28天。记录小鼠体重变化，计算小鼠增重率；通过Morris水迷宫和平衡木实验观察小鼠的行为学变化；处死小鼠后收集小鼠血液，采集大脑称重并记录，计算脑体比；石蜡切片和Hamp;E染色观察脑组织病理变化；测定脑组织中的氧化应激指标（T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px）；ELISA测定小鼠血清中的炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）水平；Westemblot和免疫组化实验检测脑组织中TLR4、TRIM32、LC3表达水平。<br>　　3.处死小鼠前12h使用代谢笼收集小鼠尿液，处死小鼠后收集小鼠血液，采集大脑称重并记录。首先对检测小鼠血液、尿液和脑组织中的Hg含量的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）方法进行评价，然后再分别检测小鼠血液、尿液和脑组织中的Hg含量。<br>　　结果：<br>　　1.成功制备Pue-PLGA-nps，粒径为（121.1±0.9074）nm（PDI=0.084±0.011），粒径合适，且分布均匀，Zeta电位为（-25.9±1.27）mV,包封率为（85.87±0.51）%，载药量为（48.67±2.08）%，SEM观察Pue-PLGA-nps干粉的形态Pue粉末颗粒明显，悬浮液的形态显示出外观圆整，破损程度较低，能有效地在实验中使用。体外释放结果表明，在同一条件下，Pue的释放速度明显高于Pue-PLGA-nps，6h的累计释放率达到了（97.96±0.93）%，而Pue-PLGA-nps6h释放率仅为（36.54±5.11）%，并且Pue-PLGA-nps释放开始阶段药物浓度升到一定值之后，在第五天进入稳定释放阶段，释放率达到（82.17±2.05）%，释放速度下降，释放时间长。体外释药曲线与Weibull方程拟合程度最高，拟合方程为lnln[1-(1-Q)]=0.44394lnt-1.3204（R2=0.9777）。体内代谢实验结果显示，在不同取样时间点上，Pue-PLGA-nps组血浆中和脑组织中的Pue浓度均高于Pue组。药物动力学参数的计算结果显示，在血浆中，Pue-PLGA-nps的AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax、tmax、t1/2、MRT(0-t)、MRT(0-∞）分别是Pue的1.929、2.217、1.568、0.875、1.703、1.196、1.687倍；而在脑组织中，Pue-PLGA-nps的AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax、tmax、t1/2、MRT(0-t)、MRT(0-∞)分别是Pue的1.973、2.088、1.282、1.400、2.295、1.511、1.844倍。<br>　　2.成功建立了HgCl2诱导的小鼠脑损伤模型，使用Pue和Pue-PLGA-nps干预能够改善HgCl2导致的小鼠体重增加的减少和脑体比的增加，逆转HgCl2导致的小鼠学习记忆能力和平衡能力的改变，并减轻HgCl2导致的小鼠脑组织病理损伤。同时Pue和Pue-PLGA-nps不仅能够通过下调MDA水平，上调T-AOC、SOD、GSH-Px的表达，减轻HgCl2导致的小鼠脑组织氧化应激损伤，还能通过下调促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达，减轻HgCl2诱导的炎症反应。进一步研究发现Pue和Pue-PLGA-nps下调了炎症调控因子（TLR4）、自噬相关蛋白（LC3）及TRIM32的表达。实验结果表明，Pue和Pue-PLGA-nps对HgCl2诱导的小鼠脑损伤有一定的保护作用，并且Pue-PLGA-nps干预效果优于Pue。<br>　　3.本研究建立的ICP-MS检测小鼠血液、尿液和脑组织中Hg含量的方法，在0μg/L~5μg/L的线性范围内相关系数为R=0.9989，仪器检出限为0.017μg/L，定量限为0.056μg/L，满足测定的要求。在样品测定过程中，将3μg/L的质控溶液进行穿插检验，测定均值为2.99μg/L，RSD为0.5%，说明仪器在检测过程中具有较高的稳定性；GBW10018中Hg元素的测定均值为3.61±0.14μg/g，接近证书的参考值3.6±1.5μg/g，说明本方法具有较高的准确性；在加标回收试验中，低、中、高（0.5、1、3μg/L）3种浓度测定结果在95%~105%范围内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。样品的测定结果表明，长期暴露于HgCl2，可引起小鼠脑组织、血液和尿液Hg的蓄积。使用Pue和Pue-PLGA-nps干预后，可以降低小鼠脑组织、血液和尿液中的Hg含量，并且实验结果显示Pue-PLGA-nps干预效果优于Pue。<br>　　结论：<br>　　1.本研究制备的Pue-PLGA-nps性能良好，具有一定的缓释效应，能够增强药物在体内的吸收，为开发Pue新的口服制剂奠定实验基础。<br>　　2.HgCl2暴露会引起小鼠脑损伤，而Pue-PLGA-nps可以通过TLR4/TRIM32/LC3途径减轻HgCl2引起的氧化应激、炎症反应、自噬，以及促进Hg在小鼠体内的排出，缓解HgCl2暴露诱导的脑损伤，并且干预效果优于Pue，Pue-PLGA-nps的成功制备为HgCl2暴露诱导的脑损伤的临床治疗提供了新的药物制剂。