摘要目的:本研究旨在探究神经元电活动在转录和翻译水平对孤独症易感基因2(Autismsusceptibilitycandidate2,Auts2)同源异构体的调控及其机制。<br> 方法:体外细胞实验中,我们取胚胎16天(Embryonicstage16,E16)小鼠脑皮层组织培养原代神经元至5天(5daysinvitro,DIV5)时,在培养基中加入氯化钾(Potassiumchloride,KCl)作用2、6、12小时使神经元兴奋,或在培养基中加入河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)作用2小时和12小时使神经元抑制,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)和WesTM全自动蛋白表达分析(WesternTMAutomatedWesternBlotassays,Wes)检测Auts2异构体在mRNA和蛋白水平的表达。在培养至DIV5的原代皮层神经元中加入KCl刺激神经元,并同时加入放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻止翻译后,通过Wes分析Auts2同源异构体蛋白表达,探索其调控机制是在翻译水平,还是蛋白质本身发生降解。另在培养至DIV5的原代大脑皮层神经元培养基中,加入KCl的同时加入N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-asparticacidreceptor,NMDAR)阻断剂2-氨基-5-磷酸戊二酸盐(2-amino-5-phosphonovalericacid,AP5)作用12小时后通过RT-qPCR和Wes分析Auts2异构体在mRNA和蛋白水平的表达,观察AP5能否逆转神经元兴奋后Auts2同源异构体的变化。动物模型实验中,我们将断奶后的雄性C57BL/6J小鼠分别在丰富环境(Enrichedenvironment,EE)和独居环境(Singlehoused,SH)中饲养4周,利用充足的感觉和社交刺激使小鼠大脑兴奋,并通过RT-qPCR和Wes分析不同居住环境下的小鼠皮层和海马Auts2异构体在mRNA和蛋白水平的表达。<br> 结果:(1)在KCl刺激神经元2小时后,全长auts2(Full-lengthauts2,FL-auts2)的mRNA表达没有变化(P>0.05),但auts2mRNA总和(Total-auts2)表达显著减少。全长Auts2蛋白(Full-lengthAuts2,FL-Auts2)以及Auts2同源异构体1(Auts2variant1,S-Auts2var.1)蛋白表达没有变化。此外,在KCl刺激神经元6小时后,Auts2的mRNA和蛋白表达均保持不变。在KCl持续刺激神经元12小时后,FL-auts2和Total-auts2的mRNA表达显著减少,FL-Auts2和S-Auts2var.1的蛋白表达亦显著减少。CHX阻止翻译的同时KCl持续刺激神经元12小时,FL-Auts2的蛋白表达有降低趋势,S-Auts2var.1的蛋白表达与对照组相似。(2)神经元电活动受抑制2小时,FL-auts2和Total-auts2的mRNA表达增加,但FL-Auts2和S-Auts2var.1的蛋白表达无明显改变;神经元电活动持续受抑制12小时,Auts2的mRNA和蛋白表达均无显著变化。(3)在KCl刺激神经元兴奋时加入AP5阻断NMDAR,FL-Auts2和S-Auts2var.1蛋白表达的与对照组相比无差别,但auts2的mRNA表达与对照组相比仍显著下降。(4)在丰富环境中饲养的小鼠受到足够的感觉和社交刺激后,其海马Auts2的蛋白表达亦显著下降,但皮层的Auts2蛋白表达无明显改变。<br> 结论:(1)持续的神经元电活动刺激抑制了Auts2在体外和动物模型的表达。(2)抑制神经元电活动使auts2的mRNA表达增加,但未能改变Auts2的蛋白表达。
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