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摘要目的：<br>　　本课题前期工作基础扎实，全国名老中医王文彦在60多年的肝纤维化的中医药临床实践中取得非常好的疗效，在长期的临床实践中分析总结出肝纤维化的病机，主要是肝郁脾虚、气滞血瘀，治则主要是疏肝健脾，活血软坚，总结临床有效经验方并研发成院内制剂软肝冲剂用于肝纤维化及早期肝硬化的防治。软肝冲剂具有疏肝健脾，活血软坚之功效，主治鼓胀（肝纤维化、肝硬化）中的肝郁脾虚、气滞血瘀证型，是由柴胡、白术、郁金、鳖甲、丹参、莪术、木香、延胡索、泽泻、泽兰、连翘、水红花子组成。主要症状表现为胁痛，腹胀，食少纳呆，便溏，神疲乏力，或见胁下积块，舌质紫暗或暗淡，或见齿痕、瘀斑，脉弦细或细弱的患者均可使用。但其发挥抗肝纤维化的生物学机制需要进一步研究。本研究结合网络药理学及动物体内实验研究，探索软肝冲剂对肝纤维化的作用机制。<br>　　1.运用网络药理学的方法对软肝冲剂核心药物进行研究，探讨疏肝健脾，活血软坚中药软肝冲剂治疗肝纤维化的作用环节、作用靶点以及生物学信号转导通路，这为从基础实验角度研究软肝冲剂在改善甚至逆转肝纤维化方面提供研究思路并通过动物实验学进行佐证。<br>　　2.通过体内实验建立肝纤维化大鼠模型，并根据前期基础及生物信息分析结论在动物实验层面上进一步探索通过软肝冲剂对肝纤维化大鼠模型的疗效及其可能作用机制。<br>　　材料与方法：<br>　　1.利用TCMSP数据库同时查阅相关文献，筛选软肝冲剂有效生物学成分及作用靶点。通过GeneCards网站和OMIM网站收集肝纤维化疾病的相关靶点并进行蛋白互作和拓扑分析，从而得到核心靶点，并且找出核心靶点对应的主要成分，进一步进行分析GO功能富集和KEGG通路富集，进一步分析探讨软肝冲剂治疗肝纤维化的生物学信号通路及作用环节。<br>　　2.体内实验部分除空白对照组外，其余各组进行肝纤维化造模，造模后大鼠随机分为模型组、中药软肝冲剂组以及西药秋水仙碱组，各组10只，模型组按照2mg/Kg给予40%CCl4灌胃，并给予2ml/Kg橄榄油灌胃，空白组只给橄榄油。每四天给予一次40%CCl4（2mg/Kg）、橄榄油（2ml/Kg）。造模第5周后开始给予干预性治疗药物，阳性药物组给予0.04mg/ml秋水仙碱1ml；中药组给予软肝冲剂配制成浓度为0.5g/ml的液体2ml/d灌胃。其余各组给予生理盐水灌胃。造模第8周，病理染色显示模型组肝纤维化形成。10周后取材，检测病理学、检测大鼠血清IL-6、TNF-α、AFP、ALT蛋白指标表达水平，检测大鼠肝脏NF-κB蛋白、P65mRNA、IκB-α蛋白及mRNA的表达水平，大鼠通路上下游分子TNF-α、Caspas3蛋白及mRNA表达水平的影响。<br>　　结果：<br>　　1.通过生物信息学方法筛选出肝纤维化经验方软肝冲剂活性成分244个，靶点1225个，肝纤维化疾病靶点1075个，经验方软肝冲剂治疗肝纤维化的共有靶点211个。通过蛋白互作网络和拓扑特征分析，得出CASP3、MAPK1、IL-2、IL-6、TNF、ESR1、AKT1、VEGFA、EGFR等靶点是软肝冲剂潜在的治疗核心靶点。GO富集分析显示参与的生物进程主要涉及ERK1和ERK2级联、基因表达、细胞增殖、MAPK激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、血管生成以及平滑肌细胞增殖的正调控，凋亡过程的负调控，血管生成以及蛋白质磷酸化等生物过程；KEGG富集分析得出肝纤维化经验方通过TNF通路、FoxO通路、HIF-1通路、VEGF通路、ErbB通路等信号通路治疗肝纤维化。2.动物实验（1）本研究成功复制了肝纤维化模型，可用于临床药效评价和新药研究。对肝纤维化大鼠肝脏病理的影响：10周后处死大鼠，完成免疫组化染色（HE(hematoxylin-eosin)染色），模型组显示肝细胞大泡状脂肪变，形成大量的胶原纤维。局部病灶可见肝炎改变，可见假小叶组织结构。而中药组和秋水仙碱组的肝脏病理切片则显示纤维间隔明显减小，局灶坏死细胞、以及淋巴细胞和中性粒细胞浸润现象明显减少，未见假小叶结构形成。（2）采用ELISA方法检测各组大鼠肝转氨酶ALT、IL-6、TNF-α及AFP的表达水平，实验结果显示模型组大鼠血清中ALT、IL-6、TNF-α、AFP升高明显，与空白组相比较有统计学差异（P＜0.05或P＜0.001）。给予软肝冲剂或者秋水仙碱干预，检测血清ALT、TNF-α、IL-6、AFP表达，软肝冲剂组与模型组相比明显下降（P＜0.01），表明软肝冲剂可明显降低经CC14和橄榄油处理诱导大鼠肝纤维化模型血清中转氨酶及IL-6、TNF-α炎症因子和甲胎蛋白AFP的表达水平。且软肝冲剂组与秋水仙碱组无统计学差异。（3）采用Westernblot、RT-PCR方法对TNF-α/NF-κB通路中的关键蛋白以及mRNA的表达进行检测，实验结果显示模型组大鼠肝脏NF-κB蛋白明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏NF-κB蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.05）。秋水仙碱组大鼠肝脏NF-κB蛋白表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.05）。模型组大鼠肝脏P65mRNA表达与正常组相比明显升高（P＜0.001）。软肝冲剂组P65mRNA表达较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏P65mRNA蛋白表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.001）。大鼠肝脏IκB-α蛋白的表达水平模型组明显高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏IκB-α蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.01）。秋水仙碱组大鼠肝脏IκB-α蛋白表达较模型组也呈现明显下降，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠肝脏IκBαmRNA明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏IκBαmRNA表达较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏IκBαmRNA表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.001）。（4）采用WesternBlot方法和RT-PCR方法检测TNF-α/NF-κB通路上下游关键分子肝TNF-α和Caspas3蛋白及mRNA的表达水平，实验结果显示，模型组大鼠肝脏TNF-α蛋白明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏TNF-α蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏TNF-α蛋白表达较模型组也呈现明显下降，（P＜0.05）。TNF-αmRNA表达明显增加高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏TNF-αmRNA表达较模型组明显下降（P＜0.01）。秋水仙碱组大鼠肝脏TNF-αmRNA表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.01）。模型组大鼠肝脏Caspas3蛋白明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏TNF-α蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏Caspas3蛋白表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.05）。模型组大鼠肝脏Caspas3mRNA明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.001），软肝冲剂组Caspas3mRNA表达较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏Caspas3mRNA表达较模型组也呈现明显下降（P＜0.001）。（5）采用免疫组织化学染色方法并采用基于人工智能学习的数字病理图像分析检测各组大鼠肝NF-κB、IκB1及Caspas3阳性细胞的表达水平，实验结果显示，模型组大鼠肝脏组织NF-κB阳性细胞比例明显增加（P＜0.001）。软肝冲剂组大鼠肝脏组织中表达NF-κB的细胞比例较模型组明显下降（P＜0.001），与空白对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。秋水仙碱组NF-κB的表达较模型组也呈现明显下降，（P＜0.001），与空白对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。模型组大鼠肝脏组织中表达IκB1的细胞比例明显增加，明显高于正常组大鼠（P＜0.05）。软肝冲剂组大鼠肝脏组织中表达IκB1的细胞比例较模型组明显下降但无统计学意义（P＞0.05）。秋水仙碱组大鼠肝脏组织中IκB1的表达较模型组呈现增加趋势（P＜0.05）。模型组大鼠肝脏组织中表达Caspas3的细胞比例增加，高于正常组大鼠，但无统计学差异（P＞0.05）。软肝冲剂组大鼠肝脏组织中表达Caspas3的细胞比例较模型组明显下降（P＜0.001）。秋水仙碱组大鼠肝脏组织中Caspas3的表达较模型组呈现增加趋势（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.恩师卢秉久的软肝冲剂由12味中药组成，具有疏肝健脾，活血软坚之功效。主治气滞血瘀及肝郁脾虚型鼓胀，与中医传承平台得出的病因病机及治则相契合。<br>　　2.Caspas3、IL-6、TNF-α等可能是经验方软肝冲剂治疗肝纤维化的核心靶点。软肝冲剂治疗肝纤维化可能主要通过TNF-α/NF-κB信号通路等通路等起作用。<br>　　3.动物整体实验显示软肝冲剂可显著减轻CCl4诱导肝纤维化大鼠的纤维化，通过调节NF-κB、IκB1的蛋白及mRNA的表达来调节肝纤维化的发展进程。<br>　　4.软肝冲剂可在一定程度上降低TNF-α/NF-κB信号通路中上下游炎症因子、凋亡因子蛋白及mRNA表达水平，抑制通路关键分子的高激活状态，抑制炎症反应，抑制TNF-α/NF-κB的作用从而可能抑制HSC的活化抗细胞凋亡等进而延缓肝纤维化进程，从而表现改善肝纤维化的作用，是一种潜在的抗肝纤维化药物。