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摘要目的:<br>　　1.基于"伏毒"理论探讨糖尿病性溃疡(Diabeticulcer,DU)难愈机制,为中医药促进糖尿病性溃疡愈合提供新的思路.<br>　　2.观察拔毒生肌散对糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合作用及其治疗机理的探讨.<br>　　材料与方法:<br>　　1.临床研究:收集20例糖尿病足患者创面组织,标记为DU组.收集20例非糖尿病患者足部正常皮肤组织,标记为正常对照(Normalcontrol,NC)组.应用苏木素-伊红(HE)染色法对病理表现进行观察,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测:晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGEs)、晚期糖基化终末产物受体(receptorforadvancedglycationend-products,RAGE)、Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白含量,免疫印迹(Western-blot)法检测:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-likeECH-associatedprotein1,Keap1)、核因子E2相关因子(nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2)蛋白表达水平,逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测:RAGE、Keap1、Nrf2、Wnt1、β-cateninmRNA相对表达量.运用中医的"取象比类"思维并基于"伏毒"理论对AGEs微观辨证.<br>　　2.实验研究:将48只大鼠腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病模型,随机分成模型组、拔毒生肌散组、中药对照组和西药对照组,喂食高脂高糖饲料4周.另取大鼠12只为正常对照组,喂食普通饲料4周.在4周后,造皮肤溃疡模型.造模后第2天开始换药,每日一次.换药方法:碘伏消毒后,正常对照组和模型组用0.9%氯化钠溶液冲洗;拔毒生肌散组外敷约6mg药粉;中药对照组外涂约2mm厚度一效膏;西药对照组外涂约2mm厚度康惠尔清创胶.各组涂药后,外敷1层凡士林纱布及2层无菌纱布,创口用胶布包好固定.在用药后第7天,各组随机抽取5只大鼠分别作为正常对照I组、模型I组、拔毒生肌散I组、中药对照I组和西药对照I组.其余大鼠为正常对照Ⅱ组、模型Ⅱ组、拔毒生肌散Ⅱ组、中药对照Ⅱ组和西药对照Ⅱ组,分别用药14天.用药过程中,给予正常对照I组和正常对照Ⅱ组饲喂普通饲料,另八组饲喂高糖高脂饲料.分别于用药第7天和14天,取材.观察糖尿病大鼠造模情况,测量体质量和血糖,各组溃疡面愈合率,运用HE染色检测组织病理,Masson染色测定组织内胶原纤维,免疫组化观察新生血管,ELISA法检测AGEs蛋白含量,RT-PCR法检测:RAGE、Keap1、Nrf2、Wnt1、β-catenin、糖原合成酶激-3β(glycogensynthaseexciter-3β,GSK-3β)mRNA相对表达量.<br>　　结果:<br>　　1.临床研究:<br>　　(1)HE染色病理表现:在NC组皮肤组织可见表皮层组织完整,鳞状上皮细胞具有正常的形态结构和致密的排列,真皮层富含胶原纤维,无明显炎症.DU组创面组织见有大量表皮层和真皮层细胞坏死,核碎裂或者溶解,伴结缔组织增生,成纤维细胞和纤维细胞的数量增加,较多的淋巴细胞和中性粒细胞浸润,损伤区四周见表皮层增厚.<br>　　(2)各组AGEs、RAGE、Wnt1、β-catenin的蛋白含量:DU组AGEs蛋白含量高于NC组(1464.85±55.06pg·mL-1vs1033.51±50.99pg·mL-1,Plt;0.01),RAGE蛋白含量高于NC组(206.58±16.02pg·mL-1vs156.08±7.09pg·mL-1,Plt;0.01),Wnt1蛋白含量高于NC组(32.58±2.89pg·mL-1vs25.22±1.29pg·mL-1,Plt;0.01),β-catenin蛋白含量低于NC组(131.71±5.90pg·mL-1vs158.30±7.94pg·mL-1,Plt;0.01).<br>　　(3)各组Keap1、Nrf2蛋白表达水平:DU组Keap1蛋白表达水平高于NC组(1.19±0.20vs0.35±0.06,Plt;0.01),Nrf2蛋白表达水平低于NC组(0.47±0.06vs1.53±0.16,Plt;0.01).<br>　　(4)各组RAGE、Keap1、Nrf2、Wnt1、β-cateninmRNA相对表达量:DU组RAGEmRNA相对表达量高于NC组(4.19±0.36vs1.00±0.09,Plt;0.01),Keap1mRNA相对表达量高于NC组(3.84±0.45vs1.00±0.13,Plt;0.01),Wnt1mRNA相对表达量高于NC组(2.86±0.34vs1.01±0.12,Plt;0.01),Nrf2mRNA相对表达量低于NC组(0.43±0.10vs1.00±0.09,Plt;0.01),β-cateninmRNA相对表达量低于NC组(0.20±0.03vs1.01±0.13,Plt;0.01).<br>　　2.实验研究:<br>　　(1)糖尿病组大鼠造模情况:糖尿病组大鼠表现为饮水量、进食量和尿量增多的症状,体质量低于正常对照组(211.88±30.94gvs357.92±25.80g,Plt;0.01),血糖高于正常对照组(26.80±2.33mmol·L-1vs6.20±0.80mmol·L-1,Plt;0.01),且≥16.7mmol·L-1.<br>　　(2)溃疡面愈合情况:正常对照Ⅰ组溃疡面明显缩小,表面干燥痂皮覆盖,无明显渗出.模型Ⅰ组的溃疡面痂皮厚,痂皮下可见炎性渗出.拔毒生肌散Ⅰ组、中药对照Ⅰ组和西药对照Ⅰ组溃疡面明显缩小,见淡红色肉芽,轻度水肿,周缘新生上皮.正常对照Ⅱ组溃疡面进一步明显缩小,干燥痂皮较小,无渗出,见毛发的再生.模型Ⅱ组溃疡面痂皮中间薄,见炎性渗出,痂皮周围厚,创缘表皮增厚,新生皮肤少.拔毒生肌散Ⅱ组、中药对照Ⅱ组和西药对照Ⅱ组溃疡面明显缩小,痂皮薄,未见明显渗出.<br>　　(3)溃疡面愈合率:模型Ⅰ组愈合率低于正常对照Ⅰ组(25.38±1.03%vs45.46±0.84%,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组愈合率高于模型Ⅰ组(40.26±1.12%vs25.38±1.03%,Plt;0.01),与中药对照Ⅰ组无显著差异(40.26±1.12%vs40.29±1.06%,Pgt;0.05),与西药对照Ⅰ组无显著差异(40.26±1.12%vs38.47±1.51%,Pgt;0.05).模型Ⅱ组愈合率低于正常对照Ⅱ组(49.86±1.10%vs80.41±0.75%,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组愈合率高于模型Ⅱ组(69.76±0.97%vs49.86±1.10%,Plt;0.01),与中药对照Ⅱ组无显著差异(69.76±0.97%vs70.74±1.12%,Pgt;0.05),与西药对照Ⅱ组无显著差异(69.76±0.97%vs69.06±0.79%,Pgt;0.05).<br>　　(4)HE染色病理表现:正常对照I组可见到大量新生表皮、成纤维细胞和新生血管,少量纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的浸润.模型I组见大范围表皮层和真皮层坏死溶解,少量坏死细胞碎片,大量成纤维细胞和纤维细胞、较多新生血管、散在淋巴细胞和中性粒细胞浸润、局部见轻微出血.拔毒生肌散Ⅰ组、中药对照Ⅰ组和西药对照Ⅰ组可见大量新生的表皮层,大量的成纤维细胞和纤维细胞,更多新生血管数量,少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润.正常对照Ⅱ组见大量新生表皮层、成纤维细胞、纤维细胞,大量的胶原纤维沉积、较大量的新生血管,局部见少量淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞浸润.模型Ⅱ组见较大范围表皮层和真皮层坏死溶解,更有坏死的细胞碎片,真皮层由增生结缔组织所修补,可见较多的成纤维细胞,纤维细胞,大量胶原纤维沉积、新生血管更多,分散的淋巴细胞和中性粒细胞浸润.拔毒生肌散Ⅱ组、中药对照Ⅱ组和西药对照Ⅱ组见大面积表皮层与真皮层坏死溶解,真皮层由增生结缔组织所修复,大量的成纤维细胞和纤维细胞、大量胶原纤维的沉积、更多新生血管、更多淋巴细胞和中性粒细胞浸润,损伤区边缘可见到新生表皮层.<br>　　(5)胶原纤维的病理表现:正常对照Ⅱ组胶原纤维大量沉积,排列比较整齐,有序.模型Ⅱ组胶原纤维蓝染较少,形状较细,胶原纤维排列紊乱,分布稀疏,空隙大.拔毒生肌散Ⅱ组、中药对照Ⅱ组和西药对照Ⅱ组胶原纤维沉积较多,形状较粗,空隙较小,排列相对整齐有序.<br>　　(6)CD34标记的新生血管表现:正常对照Ⅱ组CD34标记新生血管多,管径较粗.模型Ⅱ组CD34标记新生血管较少,管径较细.拔毒生肌Ⅱ散组、中药对照Ⅱ组和西药对照Ⅱ组CD34标记新生血管较多,管径较粗.<br>　　(7)各组大鼠溃疡肉芽组织中AGEs、RAGE表达<br>　　①模型Ⅰ组AGEs蛋白含量高于正常对照Ⅰ组(968.41±18.87ng·L-1vs750.48±37.03ng·L-1,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组AGEs蛋白含量低于模型Ⅰ组(813.73±45.40ng·L-1vs968.41±18.87ng·L-1,Plt;0.01),高于中药对照Ⅰ组(813.73±45.40ng·L-1vs746.58±30.19ng·L-1,Plt;0.05),与西药对照Ⅰ组无显著差异(813.73±45.40ng·L-1vs869.19±35.67ng·L-1,Pgt;0.05).模型Ⅱ组AGEs蛋白含量高于正常对照Ⅱ组(880.89±64.78ng·L-1vs640.00±32.98ng·L-1,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组AGEs蛋白含量低于模型Ⅱ组(793.37±56.06ng·L-1vs880.89±64.78ng·L-1,Plt;0.05),与中药对照Ⅱ组无显著差异(793.37±56.06ng·L-1vs741.82±38.70ng·L-1,Pgt;0.05),与西药对照Ⅱ组无显著差异(793.37±56.06ng·L-1vs852.73±25.95ng·L-1,Pgt;0.05).<br>　　②模型Ⅰ组RAGEmRNA相对表达量高于正常对照Ⅰ组(3.44±0.24vs1.00±0.05,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组RAGEmRNA相对表达量低于模型Ⅰ组(2.03±0.17vs3.44±0.24,Plt;0.01),高于中药对照Ⅰ组(2.03±0.17vs1.56±0.14,Plt;0.01),低于西药对照Ⅰ组(2.03±0.17vs2.36±0.16,Plt;0.01).模型Ⅱ组RAGEmRNA相对表达量高于正常对照Ⅱ组(3.30±0.20vs1.00±0.07,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组RAGEmRNA相对表达量低于模型Ⅱ组(1.96±0.12vs3.30±0.20,Plt;0.01),高于中药对照Ⅱ组(1.96±0.12vs1.68±0.06,Plt;0.05),低于西药对照Ⅱ组(1.96±0.12vs2.83±0.16,Plt;0.01).<br>　　(8)各组大鼠溃疡肉芽组织中Keap1、Nrf2表达<br>　　①模型Ⅰ组Keap1mRNA相对表达量高于正常对照Ⅰ组(2.85±0.17vs1.00±0.07,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组Keap1mRNA相对表达量低于模型Ⅰ组(1.67±0.13vs2.85±0.17,Plt;0.01),低于中药对照Ⅰ组(1.67±0.13vs1.95±0.15,Plt;0.05),低于西药对照Ⅰ组(1.67±0.13vs2.34±0.15,Plt;0.01).模型Ⅱ组Keap1mRNA相对表达量高于正常对照Ⅱ组(3.11±0.19vs1.00±0.07,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组Keap1mRNA相对表达量低于模型Ⅱ组(1.62±0.07vs3.11±0.19,Plt;0.01),与中药对照Ⅱ组无显著差异(1.62±0.07vs1.80±0.14,Pgt;0.05),低于西药对照Ⅱ组(1.62±0.07vs2.10±0.19,Plt;0.01).<br>　　②模型Ⅰ组Nrf2mRNA相对表达量低于正常对照Ⅰ组(0.32±0.04vs1.00±0.06,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组Nrf2mRNA相对表达量高于模型Ⅰ组(0.93±0.06vs0.32±0.04,Plt;0.01),高于中药对照Ⅰ组(0.93±0.06vs0.76±0.05,Plt;0.01),高于西药对照Ⅰ组(0.93±0.06vs0.68±0.03,Plt;0.01).模型Ⅱ组Nrf2mRNA相对表达量低于正常对照Ⅱ组(0.37±0.04vs1.00±0.09,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组Nrf2mRNA相对表达量高于模型Ⅱ组(0.90±0.07vs0.37±0.04,Plt;0.01),与中药对照Ⅱ组无显著差异(0.90±0.07vs0.84±0.05,Pgt;0.05),高于西药对照Ⅱ组(0.90±0.07vs0.58±0.03,Plt;0.01).<br>　　(9)各组大鼠溃疡肉芽组织中Wnt1、β-catenin、GSK-3β表达<br>　　①模型Ⅰ组Wnt1mRNA相对表达量低于正常对照Ⅰ组(0.37±0.06vs1.00±0.07,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组Wnt1mRNA相对表达量高于模型Ⅰ组(0.94±0.08vs0.37±0.06,Plt;0.01),高于中药对照Ⅰ组(0.94±0.08vs0.68±0.07,Plt;0.01),高于西药对照Ⅰ组(0.94±0.08vs0.81±0.07,P＜0.05).模型Ⅱ组Wnt1mRNA相对表达量低于正常对照Ⅱ组(0.35±0.04vs1.00±0.10,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组Wnt1mRNA相对表达量高于模型Ⅱ组(0.82±0.08vs0.35±0.04,Plt;0.01),与中药对照Ⅱ组无显著差异(0.82±0.08vs0.72±0.06,Pgt;0.05),与西药对照Ⅱ组无显著差异(0.82±0.08vs0.78±0.09,Pgt;0.05).<br>　　②模型Ⅰ组β-cateninmRNA相对表达量低于正常对照Ⅰ组(0.25±0.02vs1.00±0.08,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组β-cateninmRNA相对表达量高于模型Ⅰ组(0.70±0.07vs0.25±0.02,Plt;0.01),低于中药对照Ⅰ组(0.70±0.07vs0.90±0.09,Plt;0.05),与西药对照Ⅰ组无显著差异(0.70±0.07vs0.80±0.05,Pgt;0.05).模型Ⅱ组β-cateninmRNA相对表达量低于正常对照Ⅱ组(0.28±0.02vs1.00±0.09,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组β-cateninmRNA相对表达量高于模型Ⅱ组(0.72±0.05vs0.28±0.02,Plt;0.01),低于中药对照Ⅱ组(0.72±0.05vs0.92±0.07,Plt;0.01),低于西药对照Ⅱ组(0.72±0.05vs0.86±0.10,Plt;0.05).<br>　　③模型Ⅰ组GSK-3βmRNA相对表达量高于正常对照Ⅰ组(3.90±0.11vs1.01±0.11,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅰ组GSK-3βmRNA相对表达量低于模型Ⅰ组(2.05±0.13vs3.90±0.11,Plt;0.01),与中药对照Ⅰ组无显著差异(2.05±0.13vs1.86±0.11,Pgt;0.05),低于西药对照Ⅰ组(2.05±0.13vs2.67±0.22,Plt;0.01).模型Ⅱ组GSK-3βmRNA相对表达量高于正常对照Ⅱ组(3.37±0.23vs1.00±0.08,Plt;0.01).拔毒生肌散Ⅱ组GSK-3βmRNA相对表达量低于模型Ⅱ组(2.06±0.08vs3.37±0.23,Plt;0.01),高于中药对照Ⅱ组(2.06±0.08vs1.59±0.10,Plt;0.01),低于西药对照Ⅱ组(2.06±0.08vs2.40±0.19,Plt;0.01).<br>　　结论:<br>　　1.糖尿病性溃疡创面组织有细胞坏死,结缔组织增生,淋巴细胞和中性粒细胞浸润的病理表现,AGEs、RAGE、Keap1蛋白和mRNA高表达,Nrf2、β-catenin蛋白和mRNA低表达.<br>　　2.AGEs致病符合"伏毒"的特点;AGEs是"伏毒"致病的物质基础;DU创面组织中沉积的"伏毒"导致抗氧化和细胞增殖能力的减弱是DU难愈的机制之一.<br>　　3.拔毒生肌散能够促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合.<br>　　4.拔毒生肌散以AGEs为靶点通过祛除创面沉积的"伏毒",上调肉芽组织中Nrf2、Wnt1、β-catenin表达,下调AGEs、RAGE、Keap1、GSK-3β表达,增加胶原纤维的沉积、血管的新生和抗氧化能力,抑制溃疡面炎症的多靶点机制促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合.