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摘要传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus,IBV）是一种具囊膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科γ冠状病毒属。IBV感染细胞后，采取不连续转录机制，产生6条病毒mRNA，包括全长基因组RNA1和5条亚基因组RNA（sgRNA2-6）。前期研究结果表明，IBV-Beaudette可利用不连续转录机制产生一条非编码RNA（ncRNA），该ncRNA全长563核苷酸（nt）（不包括poly（A）尾），由IBV基因组3''-非翻译区（UTR）和长63nt的基因组5''端前导序列组成，利用反向遗传学技术获得了不形成ncRNA的病毒突变体rIBV-C27107G，发现其在Vero细胞的复制和致病性与rIBV无显著性差异，但转录组测序分析发现IBV-ncRNA可调控H1299细胞Toll-likereceptorsignalingpathway，Jak/Statsignalingpathway等信号通路上与抗病毒反应相关基因的表达。许多病毒可通过不同的机制形成ncRNA，在病毒生命周期中发挥重要作用，但IBV-ncRNA的生物学功能尚知之甚少。因此，本研究选择rIBV和rIBV-C27107G感染H1299细胞中差异表达较大的基因，采用荧光定量RT-PCR和Westernblot技术，检测相关基因在两种病毒感染细胞中的表达水平，分析该ncRNA对细胞相关因子的调控作用。主要研究结果如下：<br>　　（1）IBV-ncRNA抑制rIBV-C27107G引起的HSPA4上调表达，但增强了XRCC5的表达。在rIBV感染16小时的H1299细胞中HSPA9、HSPA4、HSP90B1、XRCC5、PPIA和UCHL1的表达量分别是MOCK组细胞中的1.12、0.17、0.97、1.94、1.83和1.62倍，而在rIBV-C27107G感染16小时的H1299细胞中它们各自的表达量分别是MOCK组细胞中的1.30、1.27、1.41、0.97、1.04和2.31倍。分析可得，rIBV-C27107G感染H1299细胞中的HSPA9、HSPA4、HSP90B1、XRCC5、PPIA和UCHL1的表达量分别是rIBV感染的细胞中的1.16、7.47、1.45、0.50、0.57和1.43倍。<br>　　（2）IBV-ncRNA可抑制由HSPA4调控的TIRAP-TRAF6-NF-κB信号通路中相关基因的表达。在rIBV感染12小时的H1299细胞中，HSPA4、TIRAP、TRAF6、NF-κB、ICAM-1和MCP-1的表达量分别是MOCK组细胞的0.44、0.59、0.41、0.62、0.47和0.53倍，而在rIBV-C27107G感染12小时的H1299细胞中这些基因的表达量分别是MOCK组细胞中的1.23、1.74、1.02、1.77、1.40和2.64倍。比较分析显示，rIBV-C27107G感染H129912小时后，细胞中HSPA4、TIRAP、TRAF6、NF-κB、ICAM-1和MCP-1的表达量分别为rIBV感染细胞中的3.24、2.95、2.49、2.85、2.98和4.98倍。<br>　　（3）IBV-ncRNA抑制了JNK的磷酸化。两种病毒感染后，在20-28小时内，JNK的磷酸化水平逐渐升高，rIBV-C27107G感染细胞中p-JNK/JNK比值分别为0.16、0.34和0.58，但在相同时间点，rIBV-C27107G感染细胞内JNK的磷酸化水平均高于rIBV感染，rIBV感染H1299细胞p-JNK/JNK比值分别为0.25、0.38、0.96。分析可知，在两种病毒感染28小时p-JNK/JNK蛋白的表达量差异最大，rIBV-C27107G感染细胞的p-JNK/JNK蛋白的表达量是rIBV感染细胞中1.66倍；<br>　　（4）IBV-ncRNA增加CyclinD1的表达量。两种病毒感染后，在12-28小时内，CyclinD1的表达量逐渐下降，但在相同时间点，rIBV感染细胞CyclinD1的表达量均高于rIBV-C27107G感染。rIBV感染H1299细胞12-28小时内不同时间点CyclinD1表达量比值分别是1.88、1.75、0.59、0.06和0.10，rIBV-C27107G感染细胞12-28小时内不同时间点CyclinD1表达量比值分别是1.85、1.19、0.19、0.03和0.06。分析可得，在两种病毒感染20小时CyclinD1的量差异最大，rIBV感染细胞的CyclinD1表达量是rIBV-C27107G感染细胞中3.11倍；<br>　　（5）IBV-ncRNA抑制c-Fos的表达。c-Fos蛋白的表达量在病毒感染16-24小时内逐渐升高，在感染24小时以后，c-Fos蛋白的表达量下降。在两种病毒感染16小时c-Fos蛋白的表达量差异最大，rIBV-C27107G感染细胞的c-Fos蛋白是rIBV感染细胞中2.47倍；<br>　　（6）IBV-ncRNA对SOCS3表达和eIF2α磷酸化无显著影响。SOCS3蛋白的表达量在两种病毒感染8-16小时内逐渐升高，在感染16小时后达到顶峰，在病毒感染20-28小时后SOCS3表达量变化不大，且在相同时间点，rIBV-C27107G感染细胞内SOCS3的表达量与rIBV感染没有显著差异；eIF2α的磷酸化水平随病毒感染时间延长逐渐升高，但两种病毒感染的细胞中p-eIF2α/eIF2α表达量比值无显著差异。<br>　　基于这些研究结果，我们推测IBV-ncRNA能抑制TIRAP-TRAF6-NF-κB通路的激活，引起下游基因ICAM-1、MCP-1等的表达减少，同时在一定程度上抑制细胞TIRAP-TRAF6-JNK通路中JNK的磷酸化，导致下游cFos蛋白的表达减少，二者可能进一步影响细胞存活和病毒复制；另外，IBV-ncRNA会诱导细胞周期蛋白D1表达增加，同时上调XRCC5的表达，可能会使停滞于G1期细胞增多，影响细胞周期。