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摘要Ⅴ型肌球蛋白是非常规肌球蛋白家族中最具有代表性的成员之一，在物种间的分布十分广泛，从出芽酵母（Myo2和Myo4）到脊椎动物（MyoⅤa、MyoⅤb和MyoⅤc）都有表达。Ⅴ型肌球蛋白在细胞内的主要功能是将各种细胞成分运送到目的地，包括多种细胞器（比如囊泡、线粒体、黑色素体等）、蛋白质分子、mRNA等等，进而参与细胞生命活动许多重要的过程，如细胞分裂、细胞迁移、胞吞胞吐、神经递质的传递等。在Ⅴ型肌球蛋白不工作时，采用一种头尾相接的自抑制的模式来避免细胞内能量的浪费；而当需要运送货物时，其ATP酶的活性和运动能力就会被激活。Ⅴ型肌球蛋白研究领域存在两个重要的科学问题：1）Ⅴ型肌球蛋白如何通过其球状尾部结构域来特异性识别细胞内种类繁多的货物；2）在识别正确货物之后，Ⅴ型肌球蛋白是如何实现从自抑制到活性构象的转变。本论文针对这两个问题进行了深入探究。<br>　　本论文的第一部分，我们利用出芽酵母中的Ⅴ型肌球蛋白Myo2作为模型，系统研究了Myo2的球状尾部结构域（Myo2-GTD）识别和结合货物的机制。本论文中采用了一种基于AlphaFold2算法的复合物预测工具ColabFold对Myo2-GTD和货物衔接蛋白的复合物进行了结构预测。首先，我们利用已知晶体结构的Myo2-GTD相关复合物来建立有效的结构预测方案，探究ColabFold对本研究的适用性，并确定了能够判断预测可信度的依据。在此基础之上，成功预测得到了Myo2-GTD与Vac17、Kar9、Pea2三个货物衔接蛋白的复合物结构，并用生化实验验证了预测结构的正确性。通过系统地比较Myo2与晶体和预测所得的六个货物衔接蛋白所形成复合物的相互作用细节，我们总结出了Myo2-GTD上三个保守位点的货物结合模式，揭示了Myo2能够特异性识别和结合多个货物的结构基础。此外，我们展示了如何利用基于AlphaFold2的结构预测来便捷地研究蛋白质-蛋白质相互作用的有效策略。<br>　　本论文的第二部分，为了揭示Ⅴ型肌球蛋白自抑制的形成及活性调控机制，我们使用鼠源的MyoⅤa进行结构生物学研究。我们利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达并纯化出了MyoⅤa全长蛋白与钙调蛋白的复合物。通过缓冲液和交联条件筛选，得到了构象均一、呈自抑制状态的MyoⅤa复合物，并利用冷冻电镜技术解析了该复合物的结构，总体分辨率为4.78埃。结构分析显示，MyoⅤa二聚体与十二个钙调蛋白结合，形成了独特的头尾相接的三角形构象。这一构象通过多种分子间和分子内的相互作用来稳定，包括头部马达结构域和球状尾部结构域的结合、钙调蛋白和卷曲螺旋的结合、卷曲螺旋和球状尾部结构域的结合以及球状尾部结构域之间的结合。通过在这些不同的相互作用面上引入突变和加入多种不同的货物，结合测定ATP酶活性的方法，我们探究了不同相互作用面在维持自抑制状态中的不同作用，并提出了货物激活MyoⅤa的分子机制。<br>　　通过以上两部分的研究，我们利用复合物结构预测工具ColabFold获得了出芽酵母中Ⅴ型肌球蛋白的球状尾部结构域与货物衔接蛋白的复合物结构，利用单颗粒冷冻电镜技术解析了近原子分辨率的鼠源Ⅴ型肌球蛋白MyoVa全长与钙调蛋白的复合物结构，阐释了Ⅴ型肌球蛋白的货物识别和结合机制，并揭示了货物的结合在Ⅴ型肌球蛋白激活过程中的调控机制。