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摘要【目的】<br>　　1.确定非小细胞肺癌中ACSS3的表达水平，评估ACSS3在非小细胞肺癌中的诊断价值，分析ACSS3的表达与患者临床指标和预后的关系。<br>　　2.通过敲除ACSS3观察非小细胞肺癌细胞生物学行为的变化，初步探讨ACSS3调控非小细胞肺癌细胞生长的相关机制，筛选新的非小细胞肺癌标志物和治疗靶点。<br>　　【方法】<br>　　免疫组织化学染色法和免疫印迹实验(Westernblot)确定ACSS3在非小细胞肺癌组织和细胞的表达情况。ROC曲线评估ACSS3对非小细胞肺癌的诊断价值，分析ACSS3的表达水平与患者临床指标及预后的关系。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除ACSS3的非小细胞肺癌细胞株，采用Westernblot实验检测稳定敲除细胞株中ACSS3的表达情况。体外实验，采用MTT法、平板克隆形成法、Transwell法检测敲除ACSS3后非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化；体内实验，构建裸鼠皮下移植瘤模型，观察ACSS3对非小细胞肺癌细胞生长的影响。采用高通量测序技术检测H460对照细胞与其ACSS3稳定敲除细胞之间转录组的表达差异，筛选差异表达基因（DifferentiallyExpressedGenes,DEGs）并进行GO和KEGG富集分析，探讨ACSS3参与非小细胞肺癌发展的潜在信号通路与作用靶点。采用微量法测定细胞乙酰辅酶A、乳酸、丙酮酸、游离脂肪酸、游离胆固醇及酮体的含量变化。Westernblot分析糖酵解途径和脂质合成途径相关蛋白表达水平的变化。<br>　　【结果】<br>　　1.结果显示，ACSS3在非小细胞肺癌组织及细胞系显著高表达（P＜0.05），其高表达可有效诊断非小细胞肺癌。生存分析显示，ACSS3高表达与非小细胞肺癌患者预后不良显著相关（P＜0.01），ACSS3表达与患者临床指标相关性分析发现ACSS3表达水平与患者性别和肿瘤大小显著相关（P＜0.05）。<br>　　2.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功地构建ACSS3基因的稳定敲除细胞株：A549-ACSS3-KO、H460-ACSS3-KO、95D-ACSS3-KO，经Westernblot验证，细胞内不再有ACSS3蛋白的表达。体外实验显示ACSS3基因稳定敲除的非小细胞肺癌细胞株，其生长能力（P＜0.05）、迁移侵袭能力（P＜0.05）均受到抑制。裸鼠皮下移植瘤实验中，ACSS3基因稳定敲除组的裸鼠移植瘤体积及重量均低于对照组（P＜0.05）。体内外实验均发现敲除ACSS3可抑制非小细胞肺癌细胞的生长。<br>　　3.应用Illumina高通量测序技术，对H460对照细胞及其ACSS3稳定敲除细胞进行转录组测序和生物信息学分析，发现敲除ACSS3后，细胞转录组间出现901个DEGs，其中包括487个上调的基因，414个下调的基因。GO分析显示，DEGs主要参与细胞的分化发育、细胞过程的调节、对刺激的反应、信号传递和细胞通讯。KEGG富集分析发现几条与肿瘤发生进展相关的Pathway信号通路，包括FoxO信号通路、Relaxin信号通路、黏蛋白类型O聚糖的生物合成、VEGF信号通路和Apelin信号通路。<br>　　4.敲除ACSS3的非小细胞肺癌细胞内乙酰辅酶A、乳酸、丙酮酸、游离胆固醇、酮体的含量出现不同程度的下降（P＜0.05），游离脂肪酸的含量变化不明显。在稳定敲除ACSS3基因的细胞系中，一些糖脂代谢酶的表达水平发生变化，PFKP、LDHA、ACLY、AceCS1、FASN的蛋白表达水平下调（P＜0.05）；PDC、ACSL1、ACAA1的蛋白表达水平上升（P＜0.05）。<br>　　【结论】<br>　　本研究发现ACSS3在非小细胞肺癌组织及细胞系中显著高表达，可有效诊断非小细胞肺癌，与患者预后不良显著相关。敲除ACSS3基因明显抑制了非小细胞肺癌细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力，其作用机制可能与其影响糖脂代谢相关酶PFKP、LDHA、ACLY、PDC、AceCS1、FASN、ACSL1、ACAA1的表达密切相关，糖脂代谢产物乙酰辅酶A、乳酸、丙酮酸、游离胆固醇、酮体的含量也发生了不同程度的改变。以上研究为探索ACSS3促进非小细胞肺癌发生进展的机制提供了一定的理论依据，有助于筛选新的非小细胞肺癌标志物和治疗靶点，以期能为临床诊治提供新的想法和思路。