摘要目的:<br> 探讨卵巢癌中的差异lncRNA对卵巢癌的EMT调控机制,本研究选择5例卵巢癌、5例正常卵巢组织,采用高通量测序筛选出差异表达的lncRNAs,利用生物信息学方法进行分析与EMT相关的lncRNAs,并预测其下游机制。在卵巢癌组织验证表达,以及细胞、动物水平验证其恶性肿瘤功能。根据生信分析来预测靶分子lncRNA下游的miRNA,推断lncRNA可能通过吸附miRNA调控下游靶基因而促进EMT在卵巢癌的恶性进展中发挥重要作用。<br> 方法:<br> 1.高通量测序检测5例卵巢癌组织和5例正常卵巢组织中差异表达的lncRNAs,运用生物信息分析,与TCGA卵巢癌患者的整体生存相关(hazardratio>1or<1),发现卵巢癌中EMT相关通路被激活,与卵巢癌的发生发展密切相关。qPCR分析EMT相关这5个lncRNAs在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达情况,以及卵巢癌细胞系中表达情况。<br> 2.将lncRNAAC005224.4过表达质粒、干扰序列瞬时转染至卵巢癌细胞SKOV3和CAOV-3,通过CCK-8实验检测卵巢癌细胞增殖能力、Tranwell迁移实验检测迁移能力、Tranwell侵袭实验检测侵袭能力。WesternBlot检测EMT相关蛋白的表达来明确lncRNAAC005224.4表达水平变化对卵巢癌细胞系恶性生物学功能的影响。<br> 3.构建裸鼠异位移植瘤模型,用慢病毒Lv-si-NC(对照慢病毒),Lv-si-AC005224.4(干扰慢病毒)分别感染SKOV3细胞,细胞接种于小鼠腋下,随着时间推移逐步生产成肿瘤,进行瘤体体积检测、瘤体重量检测。检测干扰lncRNAAC005224.4对瘤体中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vimentin)的影响。<br> 4.从我们的高通量筛选和TCGA同时筛选共表达基因,发现lncRNAAC005224.4与EMT重要转录因子如SNAI2。结合starBasev3.0、HMDDv3.0和TargetScanRelease7.2数据库,分别得到lncRNAAC005224.4靶向的miRNAs、卵巢癌疾病相关miRNAs和SNAI2基因靶向的miRNAs,三者取交集,得到7个miRNA:hsa-miR-98、hsa-let-7g、hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-140-3p。qPCR检测上述7个miRNA、SNAI2在卵巢癌组织中的表达,q-PCR检测miR-140-3p、SNAI2在卵巢癌细胞株的表达。双荧光素酶实验检测lncRNAAC005224.4与miR-140-3p、miR-140-3p与SNAI2的靶向结合;检测并分析lncRNAAC005224.4表达变化对miR-140-3p、SNAI2的影响;检测miR-140-3p表达变化对SNAI2的影响;WesternBlot检测miR-140-3p、SNAI2表达变化对EMT相关蛋白表达的影响。<br> 结果:<br> 1.本研究应用高通量测序技术,对5例卵巢癌组织和5例正常卵巢组织进行lncRNA测序分析,我们筛选得到lncRNAs差异表达(log2FC>1,P<0.05),与TCGA卵巢癌患者的整体生存相关(hazardratio>1or<1),发现卵巢癌中EMT相关5个lncRNA:AC005224.4、AC009093.2、UG0898H09、AC015912.3和AL139081.1。运用qPCR检测lncRNAAC005224.4在卵巢组织和卵巢癌细胞系中均高表达。<br> 2.CCK-8实验结果显示:在SKOV3和CAOV-3细胞系中过表达lncRNAAC005224.4可促进卵巢癌细胞增殖,干扰lncRNAAC005224.4可抑制卵巢癌细胞增殖。Transwell迁移实验结果表明:在SKOV3和CAOV-3细胞系中过表达lncRNAAC005224.4可促进卵巢癌细胞迁移,干扰lncRNAAC005224.4可抑制卵巢癌细胞迁移。Transwell侵袭实验结果表明:在SKOV3和CAOV-3细胞系中过表达lncRNAAC005224.4可促进卵巢癌细胞侵袭,干扰lncRNAAC005224.4可抑制卵巢癌细胞侵袭。在SKOV3和CAOV-3细胞系过表达lncRNAAC005224.4可抑制卵巢癌细胞中E-cadherin的表达,促进N-cadherin、Snail和Vimentin的表达;干扰lncRNAAC005224.4可促进卵巢癌细胞中E-cadherin的表达,抑制N-cadherin、Snail和Vimentin的表达。<br> 3.构建裸鼠异位移植瘤模型,Lv-si-AC005224.4(干扰慢病毒)组,瘤体体积、瘤体重量检测显著小于对照组。瘤体中WB结果显示:Lv-si-AC005224.4组相较于Lv-si-NC组肿瘤中E-cadherin表达水平显著上调,N-cadherin、Snail和Vimentin表达水平显著下调。<br> 4.miR-140-3p在卵巢癌组织以及卵巢癌细胞中表达最低。与正常卵巢组织相比,SNAI2在卵巢癌组织中高表达。过表达lncRNAAC005224.4抑制SKOV3细胞中miR-140-3p表达,干扰lncRNAAC005224.4促进SKOV3细胞中miR-140-3p的表达。过表达miR-140-3p可抑制巢癌细胞中SNAI2的表达,下调miR-140-3p可促进卵巢癌细胞中SNAI2的表达。双荧光素酶实验证实lncRNAAC005224.4与miR-140-3p存在相互作用位点,miR-140-3p与SNAI2的3’-UTR区存在靶向作用位点。过表达miR-140-3p可促进卵巢癌细胞中E-cadherin的表达,抑制N-cadherin、Snail和Vimentin的表达;过表达SNAI2可抑制卵巢癌细胞中E-cadherin的表达,促进N-cadherin、Snail和Vimentin的表达。<br> 结论:<br> 1.通过对卵巢癌组织和正常卵巢组织高通量测序结合生信分析,发现了与EMT相关的差异表达的lncRNAs,其中lncRNAAC005224.4在卵巢癌组织以及细胞中高表。<br> 2.lncRNAAC005224.4促进卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移,促进卵巢癌细胞EMT过程。<br> 3.抑制lncRNAAC005224.4的表达在动物水平起到抑制肿瘤增殖,抑制移植瘤卵巢癌组织的EMT相关蛋白表达。<br> 4.lncRNAAC005224.4/miR-140-3p/SNAI2调控轴通过EMT促进卵巢癌侵袭转移。
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