检索历史 清除

摘要研究背景：<br>　　恶性黑素瘤简称恶黑，起源于神经外胚层黑素细胞，可广泛的迁移至全身，包括皮肤、粘膜、葡萄膜、内耳和直肠等，是最具侵袭性和最为致命的恶性肿瘤之一，是皮肤癌相关死亡率的主要原因。恶黑早期诊断后通过手术切除可以取得较好的治疗效果及预后，但晚期发生转移的患者预后极差。近年来免疫疗法以及分子靶向疗法的出现显著改善了预后，但其在恶黑患者应用中广泛存在耐药和严重免疫相关的不良反应等不足，因此进一步阐明恶黑转移的分子机制对寻找新的治疗靶点提高患者临床预后具有重要意义。<br>　　上皮间质转化（EMT）是一个重要的细胞过程，过程中细胞失去上皮特征的极性、紧密连接以及相关的黏附能力，经过一系列复杂的生物学过程转变为具有间充质表型的细胞，最终获得侵袭转移的能力。三种主要的转录因子SNAIL家族、ZEB家族和TWIST家族在EMT过程的早期被激活，与EMT密切相关。其中SNAIL家族包括Snail1和Slug，是一种锌指转录抑制因子，在胚胎发生和肿瘤进展过程中调控EMT进程，可通过表观遗传方式抑制靶基因的表达，与肿瘤复发、转移和耐药机制密切相关，但Slug在恶黑中的作用及具体机制尚不明确。<br>　　目的：<br>　　研究Slug在恶黑侵袭转移过程中的作用及分子机制，进一步阐明恶黑发生发展的具体机制，为寻找恶黑更为有效的治疗靶点提供理论及实验基础。<br>　　方法与结果：<br>　　首先通过TCGA数据库分析发现EMT转录因子中，Slug在恶黑中的高表达与患者预后不良显著正相关，并且与临床分期显著相关。接着，通过qPCR方法在恶黑组织中检测了Slug在mRNA水平的表达情况，发现Slug在恶黑组织中显著高表达；同时，利用TCGA中的恶黑数据分析了Slug的表达与临床病理特征的关系，发现Slug的高表达与转移和TNM分期显著相关。接下来在多种恶黑细胞系中检测了Slug的表达水平，并在Slug表达较低的A375细胞系中构建了Slug稳定过表达的细胞系，在Slug表达较高的Mewo细胞系中构建了稳定敲低Slug的细胞系。通过CCK8实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测了Slug对恶黑细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，发现Slug可以促进恶黑细胞EMT现象的发生，增强恶黑细胞体内和体外的迁移和侵袭能力。为了研究Slug促进恶黑细胞迁移和侵袭的分子机制，对Slug过表达的A375细胞系进行转录组测序以及生物信息学分析，并通过筛选及qPCR验证，发现IGFBP3在Slug过表达的细胞中表达降低，在Slug敲低的细胞中表达显著升高，推测其可能是Slug促进恶黑发展的关键基因。为了验证我们的猜想，通过回复实验，在Slug过表达的细胞系中转染IGFBP3的质粒进行过表达，在Slug敲低的细胞系中转染了IGFBP3的siRNA进行干涉，结果发现IGFBP3过表达后显著抑制了Slug对恶黑迁移和侵袭的促进作用，IGFBP3干涉后减弱了Slug敲低对恶黑迁移和侵袭的抑制作用。随后我们检测了PI3K/Akt/GSK3β通路中的关键蛋白表达，发现Slug-IGFBP3可通过PI3K/Akt/GSK3β通路促进恶黑的侵袭及转移。为了进一步探究Slug抑制IGFBP3表达的分子机制，我们通过质谱分析检测出HDAC3与Slug在恶黑细胞中可能存在相互作用，然后利用双荧光素酶报告基因分析、免疫共沉淀实验和染色质免疫共沉淀实验，结果发现Slug与HDAC3在恶黑中确实存在相互作用，通过去乙酰化和去乳酸化抑制IGFBP3启动子的转录活性，并且在HDAC3过表达后显著促进了Slug对恶黑细胞体外的迁移和侵袭作用，加入HDAC3抑制剂后显著抑制了Slug对恶黑细胞体外的迁移和侵袭作用，表明Slug通过招募HDAC3，共同募集在IGFBP3启动子区域，通过对其组蛋白去乙酰化和去乳酸化修饰，从而抑制了IGFBP3的转录和表达，最终促进恶黑的迁移和侵袭。<br>　　结论：<br>　　Slug在恶黑中高表达并且与恶黑患者预后不良显著相关。Slug可促进恶黑细胞体内外的迁移和侵袭，Slug通过抑制IGFBP3促进恶黑迁移和侵袭。Slug抑制IGFBP3通过促进PI3K/Akt/GSK3β信号通路促进恶黑的迁移和侵袭。Slug协同HDAC3降低IGFBP3的启动子区域H3K4乙酰化修饰和H4K5乳酸化修饰，抑制IGFBP3转录，进而促进恶黑的侵袭转移。