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摘要严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2，新冠病毒）可引发以细胞因子水平异常升高为特征的免疫病理损伤，称为细胞因子风暴。细胞因子风暴是新冠病毒感染严重程度的重要标志之一，其病理生理机制尚未彻底阐明，病毒主蛋白酶NSP5在其中发挥重要作用。NSP5是内肽酶，我们推测其对位于多聚蛋白末端的NSP10-11间识别位点可能存在不完全切割，从而产生NSP10-11连接体。本课题前期使用新冠病毒NSP10蛋白抗体行Western blot检测新冠病毒细胞培养裂解物，获得两条条带，根据条带分子量大小初步判断新冠病毒天然存在NSP10-11连接体。进一步研究NSP10-11连接体与宿主细胞的互作有助于拓展对新冠病毒致病机理的认识。<br>　　本研究在前期初步证实新冠病毒天然存在NSP10-11连接体的基础上，使用NSP5和NSP10-11双质粒瞬时转染293T细胞实验分析NSP10-11产生的原因，设置NSP10-11与NSP5以1∶3-3∶1的比例共转染，检测NSP5对NSP10-11的切割效果，并以人冠状病毒NL63（HCoV-NL63）为参照，以GC376为NSP5酶活性抑制剂，并构建mTFP1-S2NSP10-11-Venus真核表达载体，利用荧光能量共振转移（FRET）实验检测NSP5对NSP10-11的切割活性。结果显示：在NSP5：NSP10-11处于天然范围2∶1时，新冠病毒NSP5不能完全切割，导致存在部分NSP10-11连接体；在人冠状病毒NL63中，NSP10-11被其NSP5完全切割，NSP10和NSP11以单体的形式存在。FRET检测新冠病毒NSP5的活性，在NSP5：NSP10-11比例处于天然范围内时，随着NSP5量逐渐增加，FRET现象只减弱并未消失，说明NSP5的活性不能完全切割NSP10-11，mTFP1和Venus一直存在能量转移，提示NSP5对NSP10和NSP11间酶切位点的酶活性较弱可能是新冠病毒NSP10-11连接体存在的重要原因。<br>　　在初步论证新冠病毒NSP10-11连接体产生原因的基础上，我们进一步研究其亚细胞定位与NSP10定位的区别。NSP10定位于核周及细胞质，分别转染①NSP10-11，②NSP10-11和NSP5，③NSP10-11和NSP5，GC376处理12h，细胞免疫荧光实验结合ImageJ软件分析研究NSP10-11的定位变化。结果显示：NSP10-11定位于细胞质及细胞核；NSP5切割NSP10-11之后，N端包括NSP10和未完全切割的NSP10-11，C端与N端一致，NSP10定位于核周及细胞质，未完全切割的NSP10-11定于细胞核及细胞质；GC376抑制NSP5酶切活性后，NSP10-11定位于细胞质及细胞核；说明NSP10-11与NSP10具有不同的亚细胞定位。<br>　　我们继续研究NSP10-11的宿主互作蛋白及对宿主蛋白功能的影响。通过亲和纯化质谱联用（IP-MS）技术结合Co-IP发现，NSP10与NKRF互作，刺激IL-8的表达（与文献报道一致），敲低NKRF减弱这种影响。NSP10-11不与NKRF互作，而与FAF2互作，诱导内质网应激因子ATF6表达上调，敲低FAF2减弱这种影响。<br>　　综上所述，本研究初步证实了新冠病毒非天然存在NSP10-11连接体，发现NSP5酶切活性较弱是NSP10-11连接体存在的原因之一，证实NSP10-11与FAF2互作诱导内质网应激因子ATF6表达上调，本研究拓展了新冠病毒与宿主互作机理的认识。