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摘要背景：<br>　　结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，并且在年轻人中的发病率呈逐年上升的趋势。近期调查显示，从早期腺瘤发展为恶性CRC后，患者的5年生存率急剧下降。结肠腺癌（colonadenocarcinoma，COAD）为CRC最常见的组织学类型之一，在发展为COAD的过程中，早期时大多数为良性病变，在进一步的发展中才具有侵袭性并发生转移，扩散到邻近的器官，导致死亡率和复发率居高不下。在治疗方面，行根治性手术切除并配合化疗与放射治疗仍是首选治疗方案，但大部分患者对化疗的副作用无法耐受，并在一定程度上会影响患者的身体状况，导致治愈率进一步下降。但目前仍然没有可靠的生物标志物可以对其进行预后评价，这对于COAD患者选择有效的治疗方法仍然是一项挑战。因此，迫切需要建立全新的、稳定的预后评估指标，以便更好的预测COAD患者的预后情况，从而指导临床治疗。<br>　　RNA结合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)是真核细胞中与RNA结合的蛋白质，是转录后修饰过程的关键因子，在一些重要的细胞过程如RNA的剪接、修饰、运输、定位、稳定性、降解和翻译中起着至关重要的调节作用。由于RBPs的全方位和多功能调节作用，即使很小的变化也能引起显著的生理和病理效应。因此，RBPs的失调与许多人类疾病密切相关，尤其在大多数恶性肿瘤的发生和发展中起关键作用。<br>　　目前，对RBPs在COAD中的预后价值及发病机制方面仍缺乏系统性研究，因此对COAD患者进行亚型分类、免疫治疗预测、核心基因表达水平的分子生物学层面验证及临床预后价值探讨等系统研究，将会填补临床与科研领域的部分空白，为COAD患者带来福音。<br>　　目的：<br>　　基于生物信息学分析手段描绘COAD患者的基因表达特征并筛选对COAD的预后具有明显预测价值的标志物。进一步利用免疫组化实验检测临床COAD患者组织及其癌旁组织中关键标志物的表达情况，对预测结果进行验证。最后利用分子生物学实验验证关键标志物在COAD肿瘤细胞系中的表达情况，并进一步探究其表达水平的抑制是否会对肿瘤细胞系的迁移、侵袭能力产生影响以及是否会诱导肿瘤细胞发生凋亡。<br>　　方法：<br>　　1基于R语言及Perl语言等计算机程序语言对从TCGA数据库和GEO数据库获取的COAD患者的基因表达谱数据和相关临床信息资料进行格式统一、对数转换及批次校正等数据处理。通过广泛的文献前期检索，收集并整理RNA结合蛋白编码基因（RBPs）用于后续研究。<br>　　2基于非负矩阵分解算法将不同临床样本的分子亚型特征进行聚类。利用R语言中的“survival”包和“NMF”包，根据RBPs的表达谱对COAD样本进行聚类。通过上述计算机语言，进行分子亚型的生存分析、临床特征差异分析以及免疫相关分析（免疫细胞浸润分析和免疫检查点分析）等。<br>　　3基于Cox比例风险回归模型构建COAD患者的RBP预后风险预测模型。随机将数据分为训练集和验证集，依据R语言分析中位风险评分将COAD患者区分为高危组和低危组。通过Kaplan-Meier方法对训练和验证数据集进行生存分析并构建ROC曲线，评价预后风险模型的预测能力及准确性。运用“timeROC”包，将本模型与已报道预后模型进行对比研究。<br>　　4基于在线数据库UALCAN和HPA以及免疫组化实验，检测COAD组织及其癌旁组织中核心标志物的表达情况，在从临床角度对生物信息学分析结果进行验证。<br>　　5基于分子生物学实验，验证预测得到的核心基因在结肠腺癌细胞系中转录和翻译水平的差异。进一步通过抑制核心基因的表达，并使用细胞迁移、侵袭及凋亡等基础实验技术来探究其在肿瘤细胞中的作用。<br>　　结果：<br>　　1通过对数据的收集与处理，本研究获得了TCGA-COAD队列包括41个癌旁样本和473个肿瘤样本的56753个基因的表达数据；而GSE39582队列包括19个癌旁样本和566个肿瘤样本的20174个基因的表达数据。基于文献，我们收集并整理了1542个公认的RNA结合蛋白编码基因。<br>　　2基于非负矩阵分解聚类算法，本研究获得了2种分子亚型，并对亚型特征进行了描述。其中，亚型1患者与较长的生存期更相关。临床数据分析显示，亚型1中包含更早期的肿瘤分型。免疫浸润分析显示，亚型1中CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞和肥大细胞较多而γδT细胞和M0巨噬细胞较少。此外，所有免疫相关检查点在亚型1中的表达水平都较低。<br>　　3基于Cox比例风险回归模型，本研究通过训练集数据构建了一个新的RBPs相关预后模型，共包含8个RBPs基因（包括SRP14、DHX15、MRPS7、CLK1、LARS2、C11orf68、RRNAD1和CWF19L2）。本模型可以将预后较差的高危组人群与低危人群明显区分开，而这一预测潜力，在验证集数据中得到了证实。此外，在免疫分析方面，低风险组患者对免疫治疗的反应更好且高风险组患者更有可能发生免疫逃避。<br>　　4基于在线数据库UALCAN和HPA证实COAD组织中DHX15的蛋白水平高于正常结肠组织。此外，本研究还对收自锦州医科大学附属第一医院大肠外科的20对COAD患者的癌及癌旁组织切片进行了免疫组化分析，结果显示DHX15在COAD组织中的蛋白水平显著升高。<br>　　5利用qRT-PCR检测核心基因DHX15在DLD-1、SW480、SW48、HCT116、HT29（人结肠腺癌细胞）和NCM460细胞系（人正常肠上皮细胞）中的mRNA表达水平。结果显示，与NCM460细胞系相比，结肠癌细胞系中DHX15的mRNA和蛋白的表达水平明显升高（p＜0.05）。在抑制了DHX15的表达后，肿瘤细胞的迁移、侵袭和凋亡均出现了不同程度的改变。<br>　　结论：<br>　　1本研究基于多种计算机编程语言分析了在COAD发生时，患者基因表达的差异变化并将不同临床样本的分子亚型特征进行聚类分析，描绘不同亚型间的基因表达谱，并构建了一个全新的、稳定的RBPs基因相关的预后评估模型，可用于预测COAD患者的预后和免疫治疗反应。这一模型在预测COAD疾病发展走向中极具临床潜力。<br>　　2本研究通过在线数据库与免疫组化实验进一步验证了生物信息学的预测结果，即DHX15在COAD患者中显著上调，表明DHX15有望成为COAD患者预后评估的生物标志物。<br>　　3本研究基于全面分析确定的DHX15的表达水平在COAD细胞系中显著上调，并在敲低其表达时，对肿瘤细胞表型（细胞迁移、侵袭及细胞凋亡）产生了显著影响，这为理解COAD发病机制提供新的见解。