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摘要目的：<br>　　慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD）是一种发病率、病死率极高的慢性炎症性疾病，具有高度异质性。探索COPD的发病机制，对未来临床中COPD的早期诊断和精准化治疗具有重要意义。越来越多的研究发现，嗜酸性粒细胞（Eosinophil，EOS）与COPD的发生发展具有相关性，但具体机制尚不完全明确。有研究提示EOS外泌体可能影响COPD中肺上皮细胞的存活。此外，还有研究发现EOS可能与铁介导的细胞损伤有关。因此，针对肺上皮细胞的存活是否与铁死亡有关，我们开展了系列研究。细胞铁死亡是一种新型细胞死亡方式，酯酰CoA合成酶长链家族成员4（Acyl-CoAsynthetaselong-chainfamilymember4,ACSL4）是铁死亡的关键因子。细胞中的剪切型XBP1（spliced-boxbindingprotein-1,sXBP-1）具有转录激活作用，在EOS谱系的最终分化中起着不可或缺的作用。XBP1参与多种疾病的铁死亡过程，利用JASPAR预测发现ACSL4可能是XBP1的潜在靶基因。并且细胞中的剪切型XBP1mRNA可掺入外泌体并释放到细胞外。因此，本文主要从以下三方面对EOS在COPD中的作用进行探究：（1）探讨EOS与COPD在临床水平的相关性；（2）探讨ACSL4介导的肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性；（3）探索EOS是否通过外泌体携带sXBP1至肺上皮细胞，并靶向转录激活ACSL4，促使肺上皮细胞发生铁死亡。<br>　　方法：<br>　　第一部分嗜酸性粒细胞与COPD患者的相关性研究<br>　　1.收集AECOPD患者并根据入院嗜酸性粒细胞百分比（EOS%）将所有患者分为EOS组（EOS%≥2%）和非EOS组（EOS%＜2%）。再根据吸烟情况将所有患者分为吸烟与非吸烟亚组。<br>　　2.收集患者的一般资料、病程、住院时间、激素使用、无创辅助通气治疗、入院时实验室检查结果（白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、EOS%、PaO2、PaCO2及CRP等）、mMRC评分及CAT评分问卷，并采集患者肺功能数据及胸部CT图像。<br>　　3.基于深度学习nnU-Net模型的生物医学图像分割方法，测量患者左右及全肺体积、左右及全肺气肿指数、气道体积的影像变化。<br>　　4.利用SPSS25.0对所有数据进行统计分析。<br>　　第二部分ACSL4介导肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性研究<br>　　1.利用香烟烟雾提取物（CigaretteSmokeExtract，CSE）建立COPD小鼠模型，并滴注ACSL4干扰慢病毒或其阴性对照慢病毒。<br>　　2.通过肺功能检测、HE染色、普鲁士蓝染色、Real-timePCR、Westernblot、试剂盒检测及透射电镜检测COPD小鼠模型肺组织中铁死亡情况。<br>　　3.利用不同浓度的铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1，Fer-1）干预肺上皮细胞（BEAS-2B），同时利用CSE诱导COPD细胞模型。通过CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法、Real-timePCR、Westernblot检测细胞中铁死亡情况，并筛选出最佳剂量的Fer-1。<br>　　4.构建ACSL4siRNA及对照NC，并转染至BEAS-2B细胞，利用CSE诱导COPD细胞模型。通过CCK-8、试剂盒检测、Real-timePCR、Westernblot、BODIPY581/591C11探针法及透射电镜检测细胞中铁死亡情况。<br>　　第三部分嗜酸性粒细胞外泌体源sXBP1靶向ACSL4调节肺上皮细胞铁死亡的分子机制研究<br>　　1.收集健康人及COPD患者全血，利用人全血嗜酸性粒细胞分离试剂盒分选EOS。流式细胞术鉴定EOS纯度、台盼蓝染色检测EOS活力。提取EOS外泌体，利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法、Westernblot检测外泌体表面蛋白CD63对外泌体进行鉴定。将健康人和COPD患者来源的EOS外泌体分别与BEAS-2B细胞共培养，通过Real-timePCR、Westernblot检测BEAS-2B细胞中sXBP1mRNA及其蛋白表达水平。荧光显微镜观察BEAS-2B细胞对EOS外泌体的摄取。CCK-8检测细胞活力。<br>　　2.利用Real-timePCR、Westernblot检测COPD小鼠模型肺组织中sXBP1的表达水平。<br>　　3.利用Real-timePCR、Westernblot检测在CSE与Fer-1共同干预的BEAS-2B细胞中sXBP1mRNA及其蛋白的表达水平。<br>　　4.构建sXBP1siRNA及NC并转染至BEAS-2B细胞，利用CSE诱导COPD细胞模型，通过Real-timePCR、Westernblot、CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法、透射电镜对细胞铁死亡情况进行检测。<br>　　5.单独转染sXBP1siRNA，或共同转染sXBP1siRNA和oe-ACSL4至BEAS-2B细胞，利用CSE诱导COPD细胞模型。通过Westernblot、CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法检测细胞中铁死亡情况。<br>　　6.构建含有人ACSL4启动子的pGL3-Basic载体及人sXBP1表达质粒，共同转染至工具293T细胞。利用双荧光素酶实验验证sXBP1与ACSL4的靶向关系。<br>　　结果：<br>　　第一部分嗜酸性粒细胞与COPD患者的相关性研究<br>　　1.与非EOS组相比,EOS组患者的病程更短，白细胞计数、中性粒细胞百分比、NLR、CRP更低,淋巴细胞百分比更高（P＜0.05）。<br>　　2.在非吸烟亚组中,EOS组的右肺体积、右肺上叶体积、左肺体积、左肺上叶体积、全肺体积、左肺气肿指数、全肺气肿指数均小于非EOS组,差异均有统计学意义(P＜005)。<br>　　第二部分ACSL4介导肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性研究<br>　　1.CSE组小鼠呼吸频率和增强间歇显著增加，肺组织出现肺气肿改变，证明COPD小鼠模型构建成功。与正常对照组相比，CSE组小鼠肺组织中ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显升高，GPX4、FTH蛋白表达降低。CSE组小鼠肺组织中SOD活力、GSH含量明显降低，MDA含量明显升高，肺组织铁沉积增多，透射电镜下线粒体出现皱缩、嵴断裂等典型铁死亡改变。而在CSE+LV-shACSL4组小鼠肺组织中，ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显降低，SOD活力、GSH含量明显升高，MDA含量明显降低，铁死亡相关蛋白GPX4、FTH表达升高，肺组织铁离子沉积减少，透射电镜显示大部分的线粒体形态正常，嵴排列有序，清晰可见。<br>　　2.CSE诱导的COPD细胞模型的细胞活力明显降低，铁离子含量明显升高，ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显升高，脂质ROS含量明显升高。随着铁死亡抑制剂浓度的升高，细胞活力逐渐升高，铁离子含量逐渐降低，ACSL4mRNA和蛋白表达水平逐渐下降，脂质ROS含量逐渐降低。干扰ACSL4后，siACSL4组细胞中ACSL4mRNA及其蛋白表达水平明显降低，铁死亡相关蛋白GPX4、FTH表达水平明显升高，细胞活力无明显统计学差异，SOD活力明显升高，但GSH和MDA含量无明显统计学差异，铁离子含量明显降低。脂质ROS含量尽管在siACSL4组细胞中无明显统计学差异，但是在siACSL4+CSE+Fer-1干预组细胞中明显降低。siACSL4组细胞透射电镜可见大部分线粒体形态正常，可见双层膜和嵴，但仍有部分空泡化线粒体存在。<br>　　第三部分嗜酸性粒细胞外泌体源sXBP1靶向ACSL4调节肺上皮细胞铁死亡的分子机制研究<br>　　1.健康人EOS纯度为91.07%，COPD患者EOS纯度为97.21%；健康人EOS细胞活力为90.89%，COPD患者EOS细胞活力为96.77%；健康人和COPD患者的外泌体形态呈圆形或椭圆形，粒径峰值分别为139.8nm、143.8nm，EOS外泌体表面蛋白CD63呈高表达，表明EOS外泌体提取成功。<br>　　2.健康人和COPD患者的EOS外泌体中sXBP1存在差异表达。健康人与COPD患者的EOS外泌体分别与BEAS-2B细胞共培养结果显示，COPD-EOS+BEAS-2B组细胞中sXBP1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。EOS外泌体能够被BEAS-2B细胞摄取，COPD-EOS+BEAS-2B组细胞活力明显降低。<br>　　3.sXBP1mRNA和蛋白表达水平在COPD小鼠模型肺组织中均明显升高。<br>　　4.sXBP1mRNA和蛋白表达水平在COPD细胞模型中均明显升高，并且可以被Fer-1抑制。转染si-sXBP1后，COPD细胞模型中sXBP1mRNA和蛋白表达水平均明显降低，ACSL4蛋白表达水平降低，GPX4和FTH蛋白表达水平升高，细胞活力明显升高，SOD活力、GSH含量明显升高，而MDA含量明显降低，铁离子含量明显降低，脂质ROS含量明显降低，细胞大部分线粒体形态正常，可见双层膜和嵴。<br>　　5.sXBP1siRNA单独或与oe-ACSL4共同转染COPD细胞模型后，与5%CSE组相比，si-sXBP1+5%CSE组细胞sXBP1、ACSL4蛋白表达水平均明显降低，GPX4、FTH蛋白表达水平均升高，细胞活力明显升高，SOD活力和GSH含量明显升高，MDA含量明显降低，铁离子含量明显降低。共同转染oe-ACSL4对sXBP1蛋白表达无明显影响，但可逆转sXBP1siRNA对COPD细胞模型铁死亡的调控作用。尽管各组细胞之间脂质ROS含量均无明显统计学差异，但与si-sXBP1+oe-vector+5%CSE组相比，si-sXBP1+oe-ACSL4+5%CSE组细胞中脂质ROS含量呈明显上升的趋势。<br>　　6.双荧光素酶活性检测结果显示，在293T细胞中，与pGL3-Basic-Promoter组相比，过表达的sXBP1能够显著升高ACSL4启动子连接的荧光素酶的活性。<br>　　结论：<br>　　1.不同嗜酸性粒细胞水平的AECOPD患者具有不同的的影像学表型。按吸烟和非吸烟亚组分析，嗜酸性粒细胞百分比＜2%的非吸烟的AECOPD患者肺气肿影像程度更严重。<br>　　2.ACSL4参与了COPD肺上皮细胞的铁死亡，并且与CSE介导的肺上皮细胞铁死亡呈正相关。<br>　　3.EOS来源的外泌体能够被肺上皮细胞吞噬，并递送sXBP1至肺上皮细胞；sXBP1通过靶向上调ACSL4促进COPD肺上皮细胞铁死亡。