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嗜酸性粒细胞在COPD中的作用及其外泌体递送XBP1促进上皮细胞铁死亡的机制研究

摘要目的:<br>  慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是一种发病率、病死率极高的慢性炎症性疾病,具有高度异质性。探索COPD的发病机制,对未来临床中COPD的早期诊断和精准化治疗具有重要意义。越来越多的研究发现,嗜酸性粒细胞(Eosinophil,EOS)与COPD的发生发展具有相关性,但具体机制尚不完全明确。有研究提示EOS外泌体可能影响COPD中肺上皮细胞的存活。此外,还有研究发现EOS可能与铁介导的细胞损伤有关。因此,针对肺上皮细胞的存活是否与铁死亡有关,我们开展了系列研究。细胞铁死亡是一种新型细胞死亡方式,酯酰CoA合成酶长链家族成员4(Acyl-CoAsynthetaselong-chainfamilymember4,ACSL4)是铁死亡的关键因子。细胞中的剪切型XBP1(spliced-boxbindingprotein-1,sXBP-1)具有转录激活作用,在EOS谱系的最终分化中起着不可或缺的作用。XBP1参与多种疾病的铁死亡过程,利用JASPAR预测发现ACSL4可能是XBP1的潜在靶基因。并且细胞中的剪切型XBP1mRNA可掺入外泌体并释放到细胞外。因此,本文主要从以下三方面对EOS在COPD中的作用进行探究:(1)探讨EOS与COPD在临床水平的相关性;(2)探讨ACSL4介导的肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性;(3)探索EOS是否通过外泌体携带sXBP1至肺上皮细胞,并靶向转录激活ACSL4,促使肺上皮细胞发生铁死亡。<br>  方法:<br>  第一部分嗜酸性粒细胞与COPD患者的相关性研究<br>  1.收集AECOPD患者并根据入院嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)将所有患者分为EOS组(EOS%≥2%)和非EOS组(EOS%<2%)。再根据吸烟情况将所有患者分为吸烟与非吸烟亚组。<br>  2.收集患者的一般资料、病程、住院时间、激素使用、无创辅助通气治疗、入院时实验室检查结果(白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、EOS%、PaO2、PaCO2及CRP等)、mMRC评分及CAT评分问卷,并采集患者肺功能数据及胸部CT图像。<br>  3.基于深度学习nnU-Net模型的生物医学图像分割方法,测量患者左右及全肺体积、左右及全肺气肿指数、气道体积的影像变化。<br>  4.利用SPSS25.0对所有数据进行统计分析。<br>  第二部分ACSL4介导肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性研究<br>  1.利用香烟烟雾提取物(CigaretteSmokeExtract,CSE)建立COPD小鼠模型,并滴注ACSL4干扰慢病毒或其阴性对照慢病毒。<br>  2.通过肺功能检测、HE染色、普鲁士蓝染色、Real-timePCR、Westernblot、试剂盒检测及透射电镜检测COPD小鼠模型肺组织中铁死亡情况。<br>  3.利用不同浓度的铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)干预肺上皮细胞(BEAS-2B),同时利用CSE诱导COPD细胞模型。通过CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法、Real-timePCR、Westernblot检测细胞中铁死亡情况,并筛选出最佳剂量的Fer-1。<br>  4.构建ACSL4siRNA及对照NC,并转染至BEAS-2B细胞,利用CSE诱导COPD细胞模型。通过CCK-8、试剂盒检测、Real-timePCR、Westernblot、BODIPY581/591C11探针法及透射电镜检测细胞中铁死亡情况。<br>  第三部分嗜酸性粒细胞外泌体源sXBP1靶向ACSL4调节肺上皮细胞铁死亡的分子机制研究<br>  1.收集健康人及COPD患者全血,利用人全血嗜酸性粒细胞分离试剂盒分选EOS。流式细胞术鉴定EOS纯度、台盼蓝染色检测EOS活力。提取EOS外泌体,利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法、Westernblot检测外泌体表面蛋白CD63对外泌体进行鉴定。将健康人和COPD患者来源的EOS外泌体分别与BEAS-2B细胞共培养,通过Real-timePCR、Westernblot检测BEAS-2B细胞中sXBP1mRNA及其蛋白表达水平。荧光显微镜观察BEAS-2B细胞对EOS外泌体的摄取。CCK-8检测细胞活力。<br>  2.利用Real-timePCR、Westernblot检测COPD小鼠模型肺组织中sXBP1的表达水平。<br>  3.利用Real-timePCR、Westernblot检测在CSE与Fer-1共同干预的BEAS-2B细胞中sXBP1mRNA及其蛋白的表达水平。<br>  4.构建sXBP1siRNA及NC并转染至BEAS-2B细胞,利用CSE诱导COPD细胞模型,通过Real-timePCR、Westernblot、CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法、透射电镜对细胞铁死亡情况进行检测。<br>  5.单独转染sXBP1siRNA,或共同转染sXBP1siRNA和oe-ACSL4至BEAS-2B细胞,利用CSE诱导COPD细胞模型。通过Westernblot、CCK-8、试剂盒检测、BODIPY581/591C11探针法检测细胞中铁死亡情况。<br>  6.构建含有人ACSL4启动子的pGL3-Basic载体及人sXBP1表达质粒,共同转染至工具293T细胞。利用双荧光素酶实验验证sXBP1与ACSL4的靶向关系。<br>  结果:<br>  第一部分嗜酸性粒细胞与COPD患者的相关性研究<br>  1.与非EOS组相比,EOS组患者的病程更短,白细胞计数、中性粒细胞百分比、NLR、CRP更低,淋巴细胞百分比更高(P<0.05)。<br>  2.在非吸烟亚组中,EOS组的右肺体积、右肺上叶体积、左肺体积、左肺上叶体积、全肺体积、左肺气肿指数、全肺气肿指数均小于非EOS组,差异均有统计学意义(P<005)。<br>  第二部分ACSL4介导肺上皮细胞铁死亡与COPD的相关性研究<br>  1.CSE组小鼠呼吸频率和增强间歇显著增加,肺组织出现肺气肿改变,证明COPD小鼠模型构建成功。与正常对照组相比,CSE组小鼠肺组织中ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显升高,GPX4、FTH蛋白表达降低。CSE组小鼠肺组织中SOD活力、GSH含量明显降低,MDA含量明显升高,肺组织铁沉积增多,透射电镜下线粒体出现皱缩、嵴断裂等典型铁死亡改变。而在CSE+LV-shACSL4组小鼠肺组织中,ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显降低,SOD活力、GSH含量明显升高,MDA含量明显降低,铁死亡相关蛋白GPX4、FTH表达升高,肺组织铁离子沉积减少,透射电镜显示大部分的线粒体形态正常,嵴排列有序,清晰可见。<br>  2.CSE诱导的COPD细胞模型的细胞活力明显降低,铁离子含量明显升高,ACSL4mRNA和蛋白表达水平均明显升高,脂质ROS含量明显升高。随着铁死亡抑制剂浓度的升高,细胞活力逐渐升高,铁离子含量逐渐降低,ACSL4mRNA和蛋白表达水平逐渐下降,脂质ROS含量逐渐降低。干扰ACSL4后,siACSL4组细胞中ACSL4mRNA及其蛋白表达水平明显降低,铁死亡相关蛋白GPX4、FTH表达水平明显升高,细胞活力无明显统计学差异,SOD活力明显升高,但GSH和MDA含量无明显统计学差异,铁离子含量明显降低。脂质ROS含量尽管在siACSL4组细胞中无明显统计学差异,但是在siACSL4+CSE+Fer-1干预组细胞中明显降低。siACSL4组细胞透射电镜可见大部分线粒体形态正常,可见双层膜和嵴,但仍有部分空泡化线粒体存在。<br>  第三部分嗜酸性粒细胞外泌体源sXBP1靶向ACSL4调节肺上皮细胞铁死亡的分子机制研究<br>  1.健康人EOS纯度为91.07%,COPD患者EOS纯度为97.21%;健康人EOS细胞活力为90.89%,COPD患者EOS细胞活力为96.77%;健康人和COPD患者的外泌体形态呈圆形或椭圆形,粒径峰值分别为139.8nm、143.8nm,EOS外泌体表面蛋白CD63呈高表达,表明EOS外泌体提取成功。<br>  2.健康人和COPD患者的EOS外泌体中sXBP1存在差异表达。健康人与COPD患者的EOS外泌体分别与BEAS-2B细胞共培养结果显示,COPD-EOS+BEAS-2B组细胞中sXBP1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。EOS外泌体能够被BEAS-2B细胞摄取,COPD-EOS+BEAS-2B组细胞活力明显降低。<br>  3.sXBP1mRNA和蛋白表达水平在COPD小鼠模型肺组织中均明显升高。<br>  4.sXBP1mRNA和蛋白表达水平在COPD细胞模型中均明显升高,并且可以被Fer-1抑制。转染si-sXBP1后,COPD细胞模型中sXBP1mRNA和蛋白表达水平均明显降低,ACSL4蛋白表达水平降低,GPX4和FTH蛋白表达水平升高,细胞活力明显升高,SOD活力、GSH含量明显升高,而MDA含量明显降低,铁离子含量明显降低,脂质ROS含量明显降低,细胞大部分线粒体形态正常,可见双层膜和嵴。<br>  5.sXBP1siRNA单独或与oe-ACSL4共同转染COPD细胞模型后,与5%CSE组相比,si-sXBP1+5%CSE组细胞sXBP1、ACSL4蛋白表达水平均明显降低,GPX4、FTH蛋白表达水平均升高,细胞活力明显升高,SOD活力和GSH含量明显升高,MDA含量明显降低,铁离子含量明显降低。共同转染oe-ACSL4对sXBP1蛋白表达无明显影响,但可逆转sXBP1siRNA对COPD细胞模型铁死亡的调控作用。尽管各组细胞之间脂质ROS含量均无明显统计学差异,但与si-sXBP1+oe-vector+5%CSE组相比,si-sXBP1+oe-ACSL4+5%CSE组细胞中脂质ROS含量呈明显上升的趋势。<br>  6.双荧光素酶活性检测结果显示,在293T细胞中,与pGL3-Basic-Promoter组相比,过表达的sXBP1能够显著升高ACSL4启动子连接的荧光素酶的活性。<br>  结论:<br>  1.不同嗜酸性粒细胞水平的AECOPD患者具有不同的的影像学表型。按吸烟和非吸烟亚组分析,嗜酸性粒细胞百分比<2%的非吸烟的AECOPD患者肺气肿影像程度更严重。<br>  2.ACSL4参与了COPD肺上皮细胞的铁死亡,并且与CSE介导的肺上皮细胞铁死亡呈正相关。<br>  3.EOS来源的外泌体能够被肺上皮细胞吞噬,并递送sXBP1至肺上皮细胞;sXBP1通过靶向上调ACSL4促进COPD肺上皮细胞铁死亡。

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