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摘要目的：<br>　　肿瘤的异质性将导致不同基因的细胞亚群在肿瘤处空间和时间上的不均匀分布。肿瘤的空间异质性已成为一个研究热点，空间异质性可能导致癌细胞恶性转化后，仍具有活力，并继续发展分化。现在关于肿瘤异质性的研究主要通过单细胞测序，但是单细胞测序在制备单细胞的过程中将细胞独立出来，破坏了肿瘤微环境，某些基因的表达可能因此发生变化。而肿瘤的空间转录组得到的信息，不仅可以推断出相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制，而且可以辨别细胞的类型和异质性，为肿瘤诊断提供理论依据。RNA作为基因表达的执行者，而新生RNA是细胞状态最直接的反应，我们可以通过富集新生RNA，从而去预测细胞分化发育的轨迹。本文的研究目的就是开发一种技术既能对特定位点的新生RNA标记，也能将其富集出来。<br>　　方法：<br>　　1.选取细胞内不同定位的基因，与APEX2一起构建靶向定位的融合质粒，通过Western-blot和免疫荧光验证融合蛋白的表达和融合质粒的定位。2.构建由4sU介导的特定亚细胞定位的新生RNA标记系统并验证标记效率。3.根据已构建的PCDH-MITO-APEX2-Flag质粒，验证邻近标记系统的标记效率，所富集的RNA的定位以及是否为新生RNA。4.根据已构建的PCDH-G3BP1-APEX 2-Flag质粒，验证邻近标记系统地标记效率，所富集的RNA的定位以及是否为新生RNA。5.根据已构建的PCDH-PML-APEX2-Flag质粒，验证该质粒在细胞中的定位，邻近标记系统地标记效率，所富集的RNA的定位以及是否为新生R NA。<br>　　结果：<br>　　（1）Western-blot通过敷抗特定位点抗体和抗Flag抗体，证明构建的质粒可在293T细胞中表达融合蛋白，通过免疫荧光验证细胞质中定位的特定空间位点的融合质粒定位正确。<br>　　（2）EB胶验证体内外转录的RNA掺入4sU后与未掺入4sU的无明显差异，Dot blot验证体内外转录掺入4sU的RNA可与Biotin-HPDP发生共价反应并被链霉亲和素磁珠富集，Dot blot验证体内外转录掺入4sU的RNA可与Biotin-APEX2发生共价反应并被链霉亲和素磁珠富集。<br>　　（3）线粒体定位的融合质粒EB胶验证，发现经APEX2催化后，4sU标记富集得到的RNA更多，qPCR验证富集得到的RNA为线粒体定位的，通过碘乙酰胺诱导4sU反应，对T＞C进行计数，证明富集得到的RNA为新生RNA。<br>　　（4）细胞质中定位G3BP1的融合质粒EB胶验证，给予外界刺激，发现经APEX2催化后，4sU标记富集得到的RNA更多，qPCR验证富集得到的RNA定位为G3BP1定位的，通过碘乙酰胺诱导4sU反应，对T＞C进行计数，证明富集得到的RNA为新生RNA。<br>　　（5）细胞核PML小体定位的融合质粒免疫荧光验证质粒表达且定位正确，EB胶验证 4sU标记富集得到的RNA更多，qPCR验证富集得到的RNA定位为PML小体定位的，通过碘乙酰胺诱导4sU反应，对T＞C进行计数，证明富集得到的RNA为新生RNA。<br>　　结论：<br>　　首先构建融合质粒并验证表达，采用适宜浓度的4sU对细胞进行培养，在新生RNA合成时，4sU会与UTP一起合成RNA，且合成的RNA结构功能正常。将构建的融合质粒转染进入细胞，并通过特定位点的APEX2催化生物素-苯酚标记RNA，我们发现，APEX2介导的邻近标记在4sU的参与下标记效率提高，且4sU因为APEX2介导的邻近标记富集变得更容易。