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摘要背景：<br>　　鱼藤酮（Rotenone，Rot）是一种在全球范围内被广泛使用的植物性杀虫剂，主要用于控制昆虫、虱子以及用于湖泊和水库管理等。研究表明，长期暴露于Rot会产生强烈的多巴胺能神经毒性，引起运动功能障碍，从而增加帕金森病（Parkinson''sdisease，PD）的发病风险，是PD潜在的环境危险因素。<br>　　PD是全球第二大神经退行性疾病，其危害严重。PD患者除出现运动功能损伤外，大多数还会出现学习和记忆能力下降等非运动症状。学习和记忆能力主要是受小胶质细胞对神经突触进行修剪调节，小胶质细胞的调节是促进突触形成和调节神经元活动以及突触可塑性的关键过程。我们课题组最近研究发现，Rot暴露可损害小鼠海马神经元，激活小胶质细胞介导的神经炎症反应，破坏突触可塑性，进而损害小鼠的学习记忆能力。然而，Rot诱导神经炎症的潜在机制以及神经炎症如何介导下游的神经退行性变尚不明确。<br>　　补体激活（ComplementActivation）通路在免疫系统中起着关键作用。C3是补体固有成分之一，也是血清中含量最高的补体成分，而C3的裂解产物C3a可与C3a受体(C3aR)偶联结合，从而激活小胶质细胞，诱导免疫介质激活和促炎细胞因子释放，进而参与神经炎症反应。多项研究表明，补体C3/C3aR信号通路介导小胶质细胞活化和神经炎症反应，参与神经退行性变。但是，C3/C3aR通路是否参与Rot诱导的神经炎症反应和学习记忆障碍尚未见报道。<br>　　目的：<br>　　本研究利用Rot染毒小鼠模型结合C3基因敲除（C3Ko）小鼠和C3aR的抑制剂SB290157（C3aRinhibitor），探讨补体C3/C3aR通路在Rot诱导神经炎症和学习记忆障碍中的作用及机制，为阐明Rot神经毒性和相关PD的分子机理，开发新的治疗策略提供新思路。<br>　　方法：<br>　　1.Rot染毒小鼠模型：成年雄性SPF级野生型（C57BL/6）小鼠和C3Ko小鼠随机分为对照组（Con）和Rot染毒组（各15只/组）。Rot按染毒剂量1.5mg/kg腹腔注射方式染毒，每天一次，连续21天，Con组小鼠接受等量的溶剂处理。<br>　　2.C3aR抑制剂干预模型：成年雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为Con、Rot、Rot+C3aR抑制剂和C3aR抑制剂四组，每组15只，Rot染毒方法同上。在Rot染毒30分钟后通过腹腔注射方式注射C3aR抑制剂，每天一次（1mg/kg），连续21天，Con组小鼠接受等量的溶剂处理。<br>　　3.C3、C3aR表达检测：通过蛋白印迹和免疫荧光双染色检测小鼠海马组织C3、C3aR表达水平；通过qRT-PCR检测小鼠海马区C1q、C3、C3aR的mRNA水平。<br>　　4.小鼠行为学检测：应用水迷宫实验（Morriswatermaze）检测小鼠学习记忆功能变化情况。<br>　　5.神经变性和突触损伤检测：利用抗NeuN和PSD95抗体进行免疫组化和蛋白印迹分析，检测小鼠海马区神经变性和突触损伤情况。<br>　　6.胶质细胞活化和炎性因子检测：应用Iba-1和GFAP抗体进行免疫组化实验，分别检测小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况；利用qRT-PCR检测炎症因子iNOS、TNF-α和IL-1β的mRNA水平。<br>　　7.血脑屏障（Bloodbrainbarrier,BBB）通透性检测：应用纤维蛋白原（Fibrinogen）蛋白印迹实验检测小鼠BBB通透性变化，并通过蛋白印迹检测小鼠海马区紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-5）的表达水平。<br>　　8.凋亡和坏死性凋亡的检测：应用Tunel染色检测细胞凋亡情况；通过蛋白印迹检测小鼠海马细胞凋亡特异性指标Caspase3、BCL-2和Bax的蛋白表达以及坏死性凋亡特异性指标RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平。<br>　　结果：<br>　　1.染毒Rot对小鼠海马区C3表达的影响：蛋白印迹结果显示，与Con组比较，Rot染毒小鼠海马区C3蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（p＜0.01）；Elisa试剂盒检测结果显示，与Con组比较，Rot染毒小鼠海马C3a蛋白表达明显升高（p＜0.05）；免疫荧光双染结果显示，Rot染毒小鼠海马区星形胶质细胞的C3水平显著升高；qRT-PCR检测结果显示，与Con组比较，Rot染毒小鼠C3和C1q的mRNA水平明显升高（p＜0.01）。以上结果说明，Rot染毒增加了小鼠海马C3和C3a蛋白表达水平。<br>　　2.C3Ko对Rot诱导小鼠神经元损伤、突触丢失及α-突触核蛋白表达的影响：免疫组化结果显示，与野生型Con组比较，野生型Rot染毒组小鼠海马区神经元数量显著减少、突触减少；与野生型Rot染毒组相比，C3KoRot染毒组小鼠海马区神经元数目显著增加（p＜0.01）、神经突触增加（p＜0.05）；蛋白印迹结果示，与野生型Rot组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马区NeuN（p＜0.01）和PSD-95的表达（p＜0.01）明显增高；免疫荧光结果示，与野生型Rot组比较，C3KoRot染毒组海马区Ser129-α-synuclein荧光强度明显减弱（p＜0.01）；通过蛋白印迹实验结果示，与野生型Rot组比较，C3KORot染毒组小鼠海马Ser129-α-synuclein的表达仍有明显下降（p＜0.01）。<br>　　3.C3Ko对Rot诱导的小鼠学习记忆障碍的影响：水迷宫实验结果显示，与Rot染毒组小鼠相比，C3KoRot染毒组小鼠逃避潜伏期明显缩短（p＜0.01）；定位平台航行所游动的总路程显著减少（p＜0.01）；首次穿越平台所用的时间显著缩短（p＜0.05）；穿越平台总次数明显增多（p＜0.05）。结果说明，C3Ko减轻了Rot诱导的小鼠海马区学习记忆障碍的情况。<br>　　4.染毒Rot对小鼠C3aR表达的影响：蛋白印迹检测结果显示，与Con组比较，Rot染毒组小鼠海马C3aR表达水平升高（p＜0.01）；qRT-PCR的结果显示，与Con组比较，Rot染毒组小鼠海马区的C3aR含量升高（p＜0.01）；与Con组比较，Rot染毒组小鼠海马区小胶质细胞的C3aR强度显著升高（p＜0.01），神经元细胞的C3aR强度也显著升高（p＜0.05）。这些结果说明，染毒Rot增加了小鼠海马区小胶质细胞和神经元C3aR的表达。<br>　　5.抑制C3aR对Rot诱导小鼠神经元损伤、突触丢失及α-突触核蛋白表达的影响：免疫组化结果显示，与Con组比较，Rot染毒组小鼠海马区神经元数量显著减少、突触减少；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区神经元数目显著增加（p＜0.05）、神经突触增加（p＜0.01）；蛋白印迹结果示，与Rot染毒组比较，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区NeuN（p＜0.05）和PSD-95的表达（p＜0.05）明显增高；免疫荧光结果示，与Rot组比较，C3aR抑制剂+Rot染毒组海马区Ser129-α-synuclein荧光强度明显减弱（p＜0.01）；通过蛋白印迹实验结果示，与Rot染毒组比较，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马Ser129-α-synuclein的表达仍有明显降低（p＜0.05）。<br>　　6.抑制C3aR对Rot诱导小鼠学习记忆障碍的影响：水迷宫实验结果显示,与Rot染毒组比较，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠逃避潜伏期明显缩短（p＜0.01）；定位平台航行所游动的总路程显著减少（p＜0.01）；首次穿越平台所用的时间显著缩短（p＜0.05）；穿越平台的次数明显增多（p＜0.05）；结果说明，C3aR抑制缓解了Rot诱导的小鼠海马区学习记忆障碍的情况。<br>　　7.C3/C3aR轴对Rot诱导小鼠海马区小胶质细胞和星形胶质细胞激活的影响：免疫组化染色结果显示，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马区小胶质细胞和星形胶质细胞活化水平降低（p＜0.05）；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区小胶质细胞和星形胶质细胞活化水平降低（p＜0.05）。qRT-PCR的结果显示，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马区炎症因子在mRNA水平明显降低（p＜0.01）；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区炎症因子在mRNA水平也有明显降低（p＜0.01）。以上结果说明，C3Ko或者C3aR抑制可以改善Rot染毒所诱导的小鼠海马区小胶质细胞和星形胶质细胞的活化情况。<br>　　8.C3/C3aR轴对Rot诱导小鼠海马血脑屏障通透性增加的影响：蛋白印迹检测显示，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马纤维蛋白原含量也呈明显降低（p＜0.01）；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马纤维蛋白原表达水平也呈明显升高（p＜0.05）。与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马紧密连接蛋白的表达水平明显降低（p＜0.05）；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区紧密连接蛋白的表达水平明显降低（p＜0.05）。以上结果说明，调控C3/C3aR轴减轻了Rot诱导的小鼠海马BBB通透性增加的情况。<br>　　9.C3/C3aR轴在Rot染毒小鼠神经元凋亡和程序性坏死中的作用：免疫组化染色显示，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马凋亡细胞数量明显减少（p＜0.01）;与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马凋亡细胞数量也明显减少（p＜0.05）。通过蛋白印迹实验对细胞凋亡情况进行检测示，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马的Caspase3（p＜0.01）、BCL-2（p＜0.05）和Bax（p＜0.05）表达明显降低、C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马的Caspase3（p＜0.05）、BCL-2（p＜0.05）和Bax（p＜0.05）表达明显降低。通过蛋白印迹实验对细胞坏死性凋亡进行检测发现，与野生型Rot染毒组比较，C3KoRot染毒组小鼠海马P-RIPK1、P-RIPK3和P-MLKL的表达水平明显降低（p＜0.05）；与Rot染毒组相比，C3aR抑制剂+Rot染毒组小鼠海马区P-RIPK1、P-RIPK3和P-MLKL的表达水平也明显降低（p＜0.05）。结果说明，调控C3/C3aR轴能减轻Rot诱导的小鼠海马区神经元细胞凋亡和坏死性凋亡的发生。<br>　　结论：<br>　　1.补体C3/C3aR轴参与Rot诱导的小鼠学习记忆功能障碍。<br>　　2.补体C3/C3aR轴参与Rot诱导的小鼠学习记忆障碍可能与激活胶质细胞和诱导神经炎症反应有关。<br>　　3.补体C3/C3aR轴调控Rot诱导的小鼠海马神经元凋亡和坏死性凋亡。