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摘要目的：<br>　　大肠癌是指发生在结肠或直肠的肿瘤，其发病率越来越高，严重威胁着人群健康。在目前的诊疗水平条件下，初诊为早期大肠癌患者通过手术治疗为主的综合治疗往往能取得较好的疗效，而初诊为进展期的大肠癌患者，往往预后较差。所以寻找新的生物学靶分子对大肠癌进行有效干预具有重要意义。<br>　　大肠癌癌细胞的增殖、迁移和侵袭是导致大肠癌从早期进展到晚期的最为关键的生物学过程。对这些生物学过程进行研究，并探索相关生物分子进行干预对大肠癌治疗的研究十分重要。<br>　　在大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究中，大肠癌细胞的自身功能状态的变化是研究的主要内容，此外肿瘤微环境变化也是影响大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的重要因素。在肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞发挥的作用越来越受到重视。由于受到肿瘤细胞的影响，肿瘤细胞周围原有的巨噬细胞的功能发生变化，从对肿瘤细胞进行抑制和杀伤，转变为促进肿瘤细胞生长、转移，甚至帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸以及抵抗化疗药物。故在当前大肠癌的研究中，除了关注大肠癌细胞本身细胞功能的变化，其所在的大肠癌肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的变化亦需要重点关注。<br>　　大肠癌细胞及巨噬细胞功能学变化的主要原因在于肿瘤相关基因的异常表达。而转录后调控在基因异常表达的调控中发挥重要作用。转录后调控是指在信使RNA（Messenger RNA,mRNA）转录后，mRNA的翻译和表达受到调控的过程。它是一种重要的基因表达调控机制，可以调节基因表达水平，从而影响细胞的生物学功能。在转录调控分子中，微小RNA（microRNA,miRNA）扮演着重要的作用。在人体内存在大量的miRNA，它们通过结合靶基因的3?UTR降解相关基因来调控基因表达。miR-22-3p是miRNA的一种，参与了多种生物过程，包括细胞生长、分化和凋亡。近年来在多种肿瘤中发现其发挥着重要的作用，但在大肠癌中研究较少。我们在前期的工作中发现miR-22-3p在大肠癌组织中差异表达并与大肠癌患者预后相关。同时miR-22-3p可能靶向调控KDM3A分子。KDM3A是一种组蛋白赖氨酸脱甲基酶，参与基因表达的表观遗传调节。已知KDM3A参与了多种生物过程，包括细胞周期调节、干细胞分化和癌症进展。它已被证明多种癌症中上调，并与巨噬细胞极化相关，表明它可能在肿瘤发生中起作用。故我们拟探索miR-22-3p/KDM3A对大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭功能的作用以及对肿瘤相关巨噬细胞的影响，为大肠癌的治疗提供新的理论依据。<br>　　方法：<br>　　（一）探索miR-22-3p在大肠癌中的表达及临床预测价值<br>　　1.miR-22-3p在大肠癌中的表达：通过生物信息学分析GEO数据库中大肠癌组织和正常肠黏膜组织中miR-22-3p前体分子mir-22的表达差异。通过qRT-PCR检测大肠癌细胞系（CaCo2、DLD-1、SW480、SW620）、正常肠黏膜上皮细胞系NCM460中miR-22-3p的表达差异。<br>　　2.mir-22与大肠癌预后的研究：通过生物信息学分析mir-22在大肠癌患者中的表达与其预后的关系。<br>　　（二）探索miR-22-3p表达的变化对大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响<br>　　1.在大肠癌细胞中构建miR-22-3p过表达大肠癌细胞系：通过对大肠癌细胞转染miR-22-3p mimic/NC-mimic构建大肠癌细胞miR-22-3p过表达细胞和对照组细胞。通过qRT-PCR检测miR-22-3p的表达评估转染效率。<br>　　2.构建miR-22-3p低表达大肠癌细胞系：通过对大肠癌细胞转染miR-22-3p inhibitor/NC-inhibitor构建大肠癌细胞miR-22-3p低表达细胞和对照组大肠癌细胞。通过qRT-PCR检测miR-22-3p的表达评估转染效率。<br>　　3.比较不同miR-22-3p表达水平的大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力：通过CCK-8试验检测不同处理组大肠癌细胞的增殖能力变化。通过Transwell迁移试验检测不同处理组大肠癌细胞的迁移能力变化。通过Transwell侵袭试验检测不同处理组大肠癌细胞的侵袭能力变化。通过WesternBlot检测增殖、迁移、侵袭相关标志蛋白表达变化。<br>　　（三）探索miR-22-3p抑制大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力作用可能的机制<br>　　1.验证miR-22-3p与KDM3A的结合：通过生物信息学评估miR-22-3p靶向结合KDM3A的可能性及预测两者可能的结合位点。构建KDM3A3?UTR野生型荧光素酶报告基因质粒，同时根据预测的结合靶点构建KDM3A3?UTR突变型荧光素酶报告基因质粒，通过双荧光素酶报告基因试验验证miR-22-3p与KDM3A3?UTR结合。在大肠癌细胞系中过表达miR-22-3p，通过qRT-PCR和Westren Blot分别检测KDM3A mRNA和蛋白的变化，验证大肠癌细胞中miR-22-3p对KDM3A表达的影响。<br>　　2探索KDM3A在大肠癌中的作用：生物信息学分析KDM3A在大肠癌中的表达及预后作用。通过KDM3A慢病毒转染大肠癌细胞构建KDM3A过表达大肠癌细胞系。通过CCK-8、Transwell迁移、侵袭试验探索过表达KDM3A对大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　3.回复拯救实验明确KDM3A对miR-22-3p抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响：通过同时在大肠癌细胞中转染miR-22-3p mimics及过表达KDM3A，观察KDM3A过表达对miR-22-3p抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭作用的影响。<br>　　4.探索miR-22-3p/KDM3A轴对HIPPO通路关键标志物YAP1表达的影响：在大肠癌细胞中转染miR-22-3p mimics，通过Western Blot检测HIPPO通路标志蛋白YAP1表达的变化，观察miR-22-3p对HIPPO通路的影响。<br>　　结果：<br>　　（一）miR-22-3p在大肠癌中的表达及临床预测价值<br>　　1.生物信息学分析显示mir-22在正常大肠组织中的表达高于大肠癌组织。在不同细胞系检测miR-22-3p表达显示，miR-22-3p在正常肠黏膜上皮细胞的表达高于大肠癌细胞系（CaCo2、DLD-1、SW480、SW620）。<br>　　2.生物信息学的预后分析显示，mir-22的高表达与大肠癌患者的良好预后相关。<br>　　（二）miR-22-3p表达变化对大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响1.qRT-PCR检测转染miR-22-3p mimic和NC-mimic的大肠癌细胞miR-22-3p表达，显示转染miR-22-3p mimic的大肠癌细胞中，miR-22-3p表达显著升高，提示成功构建miR-22-3p过表达大肠癌细胞及对照大肠癌细胞。<br>　　2.qRT-PCR检测转染miR-22-3p inhibitor/NC-inhibitor的大肠癌细胞miR-22-3p表达，显示转染miR-22-3p inhibitor的大肠癌细胞中，miR-22-3p表达显著降低，提示成功构建miR-22-3p低表达大肠癌细胞及对照大肠癌细胞。<br>　　3.CCK-8结果显示miR-22-3p过表达的大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力较对照组降低。miR-22-3p低表达的大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力较对照组增强。<br>　　4.WesternBlot结果显示与对照组比较，miR-22-3p过表达组增殖标志物PCNA表达下降，迁移、侵袭负相关标志物E-cadherin表达上升。而在miR-22-3p低表达组，与对照组相比，其PCNA表达上升，迁移、侵袭负相关标志物E-cadherin表达下降。<br>　　（三）miR-22-3p抑制大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力作用的机制<br>　　1.生物信息学预测miR-22-3p靶向调控KDM3A分子。双荧光素酶报告基因试验证实miR-22-3p可以结合KDM3A mRNA3?UTR。对KDM3A3?UTR预测的结合位点进行突变后，双荧光素酶报告基因试验显示miR-22-3p的抑制荧光作用消失。在大肠癌细胞系中转染miR-22-3p mimic后，大肠癌细胞的KDM3A mRNA及蛋白的表达均下降。<br>　　2.生物信息学分析显示KDM3A在大肠癌中的表达高于正常组织。KDM3A的高表达与大肠癌患者的不良预后相关。在大肠癌细胞中过表达KDM3A增强了大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。<br>　　3.回复拯救实验显示KDM3A的过表达，减弱了miR-22-3p对大肠癌增殖、迁移和侵袭的抑制作用。<br>　　4.miR-22-3p在大肠癌细胞中的过表达，减少了YAP1蛋白的表达。回复拯救实验显示KDM3A的过表达，可以减弱miR-22-3p对YAP1蛋白表达的抑制作用。<br>　　结论：<br>　　1.miR-22-3p是大肠癌的差异表达分子。其在大肠癌中的过表达与大肠癌患者的良好预后相关。<br>　　2.miR-22-3p可以抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭作用<br>　　3.miR-22-3p通过靶向KDM3A调控HIPPO通路抑制大肠癌增殖、迁移和侵袭。<br>　　4.miR-22-3p在肿瘤相关巨噬细胞中差异表达，其可以部分逆转巨噬细胞向肿瘤相关巨噬细胞极化，并减弱肿瘤相关巨噬细胞的促癌作用。