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摘要糖尿病创面是指糖尿病患者遭遇皮肤溃疡、创伤后发生的皮肤破损，是糖尿患者常见并发症之一，易造成相应部位的功能改变和感觉异常。目前全球约20%的糖尿病患者伴有糖尿病创面，且还在逐年增加。目前的治疗方法清创换药、生物工程皮肤、负压创面治疗及皮瓣修复等都难以获得理想的效果。糖尿病创面迁延不愈导致创面的进一步发展，给临床治疗带来了许多困难。既往研究认为，糖尿病创面愈合延迟与高糖损害创面血管生成有关，因此促进创面血管新生具有重要的临床意义。许多研究提示外泌体可携带活性分子诱导血管新生从而加速糖尿病创面愈合。人羊膜间充质干细胞外泌体（human Amniotic Mesenchymal Stem Cell Exosomes，hAMSC-Exos）在糖尿病创面愈合过程中的作用目前还不清楚。hAMSC-Exos是否能促进血管新生以及促进血管新生的活性分子尚不明确，其发挥疗效的分子机制也有待于进一步探索。<br>　　研究目的：<br>　　探讨羊膜间充质干细胞源外泌体携OIP5-AS1靶向miR-29a-3p调控SIRT1促进糖尿病创面血管生成的作用与分子机制，为糖尿病创面的治疗提供新思路和理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　1.取健康产妇生产后废弃的羊膜组织，应用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化法分离培养hAMSCs，采用流式细胞术和成骨、成脂分化鉴定hAMSCs；采用超高速离心法提取hAMSC-Exos，通过透射电镜和western blot对其进行鉴定。取健康产妇生产后废弃的脐静脉组织，酶消化法分离培养人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），采用免疫荧光染色技术检测CD31的表达。观察HUVECs对PKH26标记的hAMSC-Exos摄取情况。CCK-8、划痕、Transwell及管腔形成实验检测hAMSC-Exos对高糖处理后的HUVECs增殖、迁移、成管的影响。制作糖尿病大鼠创面模型，观察hAMSC-Exos对糖尿病创面血管生成的影响。<br>　　2.采用Arraystar人类lncRNA芯片检测hAMSCs和hAMSC-Exos之间差异表达的lncRNAs和mRNAs；随后对差异表达mRNAs进行GO功能和KEGG通路分析并采用RT-PCR检测芯片结果的可靠性；最后筛选hAMSC-Exos中与血管生成相关的富集lncRNAs并构建ceRNA表达网。<br>　　3.RT-PCR检测OIP5-AS1、miR-29a-3p、SIRT1在糖尿病创面组织和高糖处理后HUVECs中的表达情况并检测OIP5-AS1在HUVECs中亚细胞定位。<br>　　4.将oe-OIP5-AS1、si-OIP5-AS1、miR-29a-3p mimics、miR-29a-3p inhibitor、oe-SIRT1和si-SIRT1转染高糖处理后的HUVECs，采用RT-PCR检测其转染效率。RT-PCR或western blot检测干扰或过表达干预后下游靶基因miR-29a-3p、SIRT1mRNA和SIRT1蛋白的表达水平。<br>　　5.CCK8实验、划痕实验、transwell实验、成管实验检测oe-OIP5-AS1、si-OIP5-AS1、miR-29a-3p mimics、miR-29a-3p inhibitor、oe-SIRT1和si-SIRT1转染后对HUVECs增殖、迁移和成管的影响。<br>　　6.通过RNAhybrid，TargetScan等数据库网站，预测OIP5-AS1和miR-29a-3p、miR-29a-3p和SIRT1的结合位点，并采用双荧光素酶报告基因实验验证它们之间的关系。<br>　　7.将si-OIP5-AS1+oe-SIRT1质粒和si-OIP5-AS1+oe-NC质粒共转染HUVECs，通过细胞回复实验进一步确定oe-SIRT1是否能够挽救下调OIP5-AS1对HUVECs抑制增殖、迁移、成管的作用。<br>　　8.采用western blot检测高糖处理后及转染oe-OIP5-AS1后HUVECs中PI3K/AKT信号通路相关蛋白磷酸化水平的改变。<br>　　结果：<br>　　1.从羊膜组织中分离的细胞强表达间充质干细胞标记蛋白CD44、CD73、CD90、CD105，不表达造血干细胞标记蛋白CD34、CD45和组织相容性蛋白HLA-DR；分离的细胞在体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞；证明我们分离的细胞是hAMSCs。采用超高速离心法提取的胞外囊泡直径30-150nm，表达外泌体标记蛋白CD9、CD63和CD81；证明我们分离的是hAMSC-Exos。<br>　　2.脐静脉组织中分离的细胞表达CD31，表明我们分离的细胞是HUVECs；PKH26示踪实验提示hAMSC-Exos可被HUVECs摄取；CCK-8、划痕、Transwell及管腔形成实验证实hAMSC-Exos在体外可促进高糖处理后HUVECs增殖、迁移、成管；免疫组织化学结果证实hAMSC-Exos在体内可促进糖尿病创面的血管生成。<br>　　3.芯片技术筛选出hAMSC-Exos和hAMSCs中差异表达的lncRNAs和mRNAs；GO功能和Pathway通路分析提示hAMSC-Exos富集的活性分子主要参与调节细胞膜的构建、细胞分子和受体的识别以及细胞间的信息传递，可能在伤口修复和组织再生中发挥重要作用；RT-PCR证实芯片结果可靠；ceRNA表达网提示与血管生成相关的OIP5-AS1等在hAMSC-Exos中富集，可能参与调节糖尿病创面血管生成过程。<br>　　4.RT-PCR证实OIP5-AS1、SIRT1在糖尿病创面组织和高糖处理后的HUVECs中表达下降，而miR-29a-3p的表达增加；核质分离结果证实OIP5-AS1主要分布于细胞质中。<br>　　5.CCK8、划痕、transwell、成管实验表明过表达OIP5-AS1可促进高糖处理后的HUVECs增殖、迁移和成管，干扰OIP5-AS1的表达会抑制HUVECs增殖、迁移和成管；过表达OIP5-AS1抑制miR-29a-3p的表达而促进SIRT1mRNA和蛋白的表达，干扰OIP5-AS1可促进miR-29a-3p的表达而抑制SIRT1mRNA和蛋白的表达。<br>　　6.CCK8、划痕、transwell、成管实验表明miR-29a-3p mimics抑制高糖处理后的HUVECs增殖、迁移和成管，miR-29a-3p inhibitor促进HUVECs增殖、迁移和成管；miR-29a-3p mimics抑制SIRT1mRNA和蛋白的表达，而miR-29a-3p inhibitor可促进SIRT1mRNA和蛋白的表达。<br>　　7.CCK8、划痕、transwell、成管实验表明过表达SIRT1可促进高糖处理后的HUVECs增殖、迁移和成管，干扰SIRT1的表达则抑制HUVECs增殖、迁移和成管；过表达SIRT1可增加SIRT1mRNA和蛋白的表达，干扰SIRT1则抑制SIRT1mRNA和蛋白的表达。<br>　　8.双荧光素酶报告基因实验结果表明：miR-29a-3p mimics抑制了转染OIP5-AS1WT质粒细胞的荧光素酶活性，而对转染OIP5-AS1MUT质粒细胞的荧光素酶活性无影响；miR-29a-3p mimics抑制了转染SIRT1WT质粒细胞的荧光素酶活性，而对转染SIRT1MUT质粒细胞的荧光素酶活性无影响。提示OIP5-AS1可结合吸附miR-29a-3p、miR-29a-3p可结合吸附SIRT1，从而调控它们的表达。<br>　　9.回复实验结果表明将si-OIP5-AS1分别与oe-NC、oe-SIRT1共转染HUVECs后，si-OIP5-AS1+oe-SIRT1共转染组较si-OIP5-AS1+oe-NC组HUVECs的增殖、迁移和成管作用明显增强。提示过表达SIRT1能够挽救OIP5-AS1下调抑制HUVECs增殖、迁移、成管的作用。<br>　　10.将oe-OIP5-AS1和oe-NC分别转染高糖处理后的HUVECs，相较于oe-NC组，oe-OIP5-AS1组PI3K/AKT通路蛋白磷酸化水平明显增加；表明OIP5-AS1改善高糖环境下受损的HUVECs功能可能是通过激活PI3K/AKT信号通路发挥作用的。<br>　　结论：<br>　　1.hAMSC-Exos可促进高糖处理后的HUVECs增殖、迁移、管腔形成及通过促进糖尿病创面血管生成加速创面的愈合进程。<br>　　2.OIP5-AS1通过靶向miR-29a-3p上调SIRT1的表达、激活PI3K/AKT通路改善高糖环境下受损的HUVECs功能，进而促进高糖处理后的HUVECs增殖、迁移、成管。