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摘要乳腺癌是一类由于基因突变或表达异常、激素紊乱等原因导致乳腺上皮组织发生癌变，并且无限增殖的恶性肿瘤。肿瘤细胞中的能量代谢异常活跃，作为能量载体ATP的主要产生场所，线粒体在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。NADH:泛醌氧化还原酶亚基AB1（NADH:ubiquinoneoxidoreductasesubunitAB1，NDUFAB1），作为线粒体复合物Ⅰ中的辅助亚基，在线粒体呼吸链复合体的组装和能量代谢中扮演着重要的角色。线粒体复合物Ⅰ（NADH:泛醌氧化还原酶）的功能异常被认为是线粒体中活性氧（ROS）的主要来源。目前NDUFAB1在乳腺癌恶性进展中的作用尚未见报道。本课题旨在探索NDUFAB1在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用及其分子机制，为乳腺癌患者的预防和治疗提供潜在的分子靶标。<br>　　目的：<br>　　检测线粒体蛋白NDUFAB1在临床乳腺癌患者的正常和肿瘤组织中的表达水平，探究NDUFAB1对乳腺癌细胞增殖和凋亡等功能的影响；探讨NDUFAB1在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用及其分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.通过GEO数据库下载乳腺癌单细胞数据集GSE158399（包括原发和淋巴结转移部位），利用PCA和t-SNE的方法对数据进行降维聚类，并根据特定的Marker基因识别出上皮细胞、基质细胞和免疫细胞，接着通过infercnR包计算上皮细胞中的拷贝数变异（CNV）水平，将CNV水平较高的上皮细胞定义为恶性上皮细胞，即乳腺癌细胞；利用DEsingleR包对原发和淋巴结转移部位的乳腺癌细胞基因进行差异表达分析（差异倍数1.5，p＜0.05），找到关键基因NDUFAB1后进一步分析其在肿瘤组织和正常乳腺组织的表达情况，同时分析该基因的表达与乳腺癌患者生存期的相关性。<br>　　2.分别提取正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞的总RNA和蛋白，使用RT-qPCR和Westernblot方法检测NDUFAB1的mRNA和蛋白的表达水平；收取正常乳腺组织和乳腺癌组织样本，通过RT-qPCR和免疫组化（IHC）方法检测其中NDUAFB1的表达水平。<br>　　3.构建NDUFAB1基因的过表达pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-NDUFAB1质粒，通过慢病毒的方法感染MDA-MB-231细胞。利用CCK8和平板克隆形成实验检测过表达NDUFAB1基因对MDA-MB-231细胞增殖的影响。<br>　　4.通过转染siRNA干扰片段，特异性敲低乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞中NDUFAB1的表达水平，利用CCK8和平板克隆形成实验检测乳腺癌细胞的增殖情况。<br>　　5.利用AnnexinV/PI方法检测敲低NDUFAB1表达后MDA-MB-231和BT-549细胞的凋亡情况；利用RT-qPCR方法检测Bax、Bcl-2的mRNA的表达水平，Westernblot方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved-PARP表达情况。<br>　　6.转染NDUFAB1的siRNA干扰片段，通过生物发光法检测MDA-MB-231和BT-549细胞中ATP水平变化，通过荧光染色法检测细胞内ROS水平的变化情况；Westernblot方法检测相关信号通路AMPK的磷酸化情况。<br>　　7.转染NDUFAB1的siRNA干扰片段的同时加入ROS的清除剂NAC，首先通过CCK8检测MDA-MB-231和BT-549细胞的增殖情况，再通过AnnexinV/PI方法检测MDA-MB-231和BT-549细胞的凋亡情况，最后用Westernblot检测MDA-MB-231和BT-549细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、PARP和Cleaved-PARP表达情况。<br>　　结果：<br>　　1.通过对乳腺癌单细胞测序数据分析原发部位和转移部位差异性表达的基因，发现与原发部位的肿瘤相比，转移部位的肿瘤中NDUFAB1的表达较高；通过TCGA公共数据库分析发现，肿瘤组织中NDUFAB1的表达高于乳腺正常组织，并且NDUFAB1表达高的患者生存期较短。<br>　　2.RT-qPCR和Westernblot实验结果显示，与乳腺正常上皮细胞MCF-10A相比，在乳腺癌MDA-MB-231、BT-549、MCF-7和T47D细胞中NDUFAB1的表达显著增强；通过RT-qPCR和IHC实验，检测临床组织样本中也得出同样结论，即NDUFAB1在乳腺肿瘤组织的表达水平显著高于乳腺正常组织。<br>　　3.NDUFAB1过表达对MDA-MB-231细胞的增殖无明显影响。但是转染siRNA敲低NDUFAB1的表达后，通过CCK8和平板克隆实验结果显示，乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞的增殖能力显著下降（p＜0.05）。<br>　　4.通过AnnexinV/PI方法检测发现，敲低NDUFAB1的表达能显著诱导MDA-MB-231和BT-549细胞凋亡；RT-qPCR实验结果显示，MDA-MB-231和BT-549中抗凋亡相关蛋白Bcl-2的mRNA表达下降，促凋亡蛋白Bax的mRNA表达上调；Westernblot实验结果显示，MDA-MB-231和BT-549中抗凋亡相关蛋白Bcl-2的蛋白表达下调，促凋亡蛋白Bax的蛋白表达上调，且Bax/Bcl-2和Cleaved-PARP/PARP的蛋白比值上升（p＜0.05）。<br>　　5.敲低NDUFAB1的表达后，乳腺癌细胞中ATP水平下降，而ROS的含量显著上升（p＜0.05）。同时Westernblot检测发现NDUFAB1的敲低能显著抑制AMPK的磷酸化。<br>　　6.转染NDUFAB1的siRNA干扰片段的同时加入ROS的清除剂NAC，CCK8细胞增殖实验结果显示，与si-NDUFAB1组相比，MDA-MB-231和BT-549细胞中si-NDUFAB1+NAC组细胞增殖能力上调；同时流式凋亡结果显示，MDA-MB-231和BT-549细胞中si-NDUFAB1+NAC组细胞凋亡率较si-NDUFAB1组低；最后Westernblot结果显示，在MDA-MB-231和BT-549细胞中，与si-NDUFAB1组相比，si-NDUFAB1+NAC组抗凋亡相关蛋白Bcl-2的蛋白表达上升，促凋亡蛋白Bax的蛋白表达下降，且Bax/Bcl-2和Cleaved-PARP/PARP的蛋白比值下降（p＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　NDUFAB1在乳腺癌中高表达，并与乳腺癌患者的不良预后相关。在乳腺癌细胞中，敲低NDUFAB1的表达抑制细胞的增殖能力，并通过上调细胞内ROS水平，激活线粒体信号途径，诱导细胞凋亡。