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摘要目的：<br>　　研究lncRNA SERPINB9P1在BMSC成骨分化中的作用，并探讨lncRNA SERPINB9P1是否能通过miR-545-3p调控SIRT6介导的BMSC成骨分化。该研究将揭示BMSC成骨分化新的调控途径，并为干细胞治疗相关疾病提供新的思路和潜在的治疗靶点。<br>　　方法：<br>　　我们从临床患者骨科手术中提取骨髓，采用贴壁法分离细胞悬液中的骨髓基质细胞（hBMSC），通过流式细胞术对BMSC进行表型鉴定（CD44、CD90、CD105等标记物呈阳性，且未表达CD45，CD34等标记物）。成骨培养基（OM）诱导BMSC成骨分化。通过ALP染色、茜素红S染色定性检查细胞成骨矿化情况；ALP活性测定、Western blot、灰度分析检测分化过程中关键成骨标志物ALP、RUNX2和OCN蛋白质的表达水平并进行定量分析。采用细胞转染技术构建敲除/过表达目的基因、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、双荧光素酶报告物测定及RT-PCR检测lncRNA SERPINB9P1、miR-545-3p及SIRT6mRNA的相对表达，以证实lncRNA SERPINB9P1与miR-545-3p、miR-545-3p与SIRT6之间的相互作用。最后对所有数据进行统计学处理。<br>　　结果：<br>　　1.BMSC成骨分化过程中lncRNA SERPINB9P1表达增加，miR-545-3p表达减少<br>　　首先，我们从临床患者的手术样本中分离并培养了hBMSC。通过光学显微镜下检查细胞形态及流式细胞术检测细胞表面的特异分子。光镜下具有典型形态及细胞表面分子表达CD44、CD90和CD105，而未表达CD45和CD34，从而鉴定成功分离出的细胞群为BMSC。再通过OM成骨培养基诱导BMSC成骨分化，WB定量分析发现第0、1、5、10和15天BMSC中ALP、RUNX2和OCN的蛋白质水平均逐渐增加，表明OM诱导BMSC成骨分化成功，另外一方面也说明培养的BMSC具有良好的分化能力。此外我们还利用RT-PCR检测了骨母细胞分化过程中lncRNA SERPINB9P1和miR-545-3p的相对表达水平。在骨母细胞分化过程中，随着培养时间的延长，lncRNA SERPINB9P1过表达，miR-545-3p表达受抑制，这表明lncRNA SERPINB9P1和miR-545-3p可能与BMSC的成骨分化有关。<br>　　2.LncRNA SERPINB9P1敲低抑制BMSC的成骨分化<br>　　此部分通过慢病毒转染构建sh-SERPINB9P1，oe-SERPINB9P1的BMSC并检验了敲除和过表达的效率。与对照细胞相比，sh-SERPINB9P1组BMSC表达lncRNA SERPINB9P1的水平显著降低，而oe-SERPINB9P1慢病毒感染组的lncRNA SERPINB9P1表达显著增加。细胞孵育21天后，在所有五组（对照组、sh载体组、sh-SERPINB9P1组、oe载体组、oe-SERPINB9P1组）中进行ALP和茜素红S染色，发现与对照细胞相比，敲除lncRNA SERPINB9P1后，ALP和茜素红S的染色面积减小，表明细胞内ALP的表达降低，细胞外钙盐结节数量明显少于对照组；而当lncRNA SERPINB9P1过表达时，细胞染色面积减小得到缓解，ALP的表达增加，钙盐结节数量明显多于对照组。ALP活性测定表明，与对照细胞相比，lncRNA SERPINB9P1敲低显著降低ALP活性，而oe-SERPINB9P1组ALP活性明显增高。WB实验还证明，敲低lncRNA SERPINB9P1使得ALP、OCN和RUNX2的表达水平降低，而过表达则增加了这些标记物的表达。这些结果综合表明，lncRNA SERPINB9P1的敲低可以抑制成骨分化，而过表达则可以促进其分化。<br>　　3.lncRNA SERPINB9P1对miR-545-3p具有吸附作用<br>　　lncRNA SERPINB9P1敲低或过表达后，miR-545-3p的表达水平分别发生了相应的上调或下调。生物信息预测了两者之间存在着结合位点；Ago2-RIP测定检测结果表明，与IgG组相比，Ago2组中lncRNA SERPINB9P1和miR-545-3p富集；双荧光素酶报告分析实验显示miR-545-3p模拟物降低了转染了lncRNA SERPINB9P1-WT的293T细胞中萤火虫荧光素酶活性。相反，用lncRNA SERPINB9P1-MUT转染的293T细胞中的萤火虫荧光素酶活性没有被miR-545-3p模拟物降低。这些结果表明lncRNA SERPINB9P1可以对miR-545-3p产生吸附作用。<br>　　4.lncRNA SERPINB9P1通过miR-545-3p调控BMSC成骨分化<br>　　在敲除lncRNA SERPINB9P1的基础上，额外增加miR-545-3p抑制剂，用以检测lncRNA SERPINB9P1和miR-545-3p在BMSC成骨分化中的功能关系。结果显示sh-SERPINB9P1转染导致BMSC中miR-545-3p的升高，而通过引入miR-545-3p抑制剂后消除了这一现象。随后，我们评估了成骨分化能力。与对照细胞相比，当敲低lncRNA SERPINB9P1时，ALP和茜素红S的染色面积减小，表明细胞内ALP含量和细胞外钙化结节减少；当miR-545-3p抑制剂添加到感染sh-SERPINB9P1的BMSC细胞中时，ALP含量和钙化结节减少被逆转。ALP活性测定表明，与对照细胞相比，lncRNA SERPINB9P1敲除显著降低了ALP活性，而抑制miR-545-3p的表达削弱了ALP活性的降低。WB分析还显示，当敲低lncRNA SERPINB9P1时，ALP、OCN和RUNX2的表达水平均降低，并且这种现象在miR-545-3p抑制剂处理后被阻断。除此之外，我们还发现当lncRNA SERPINB9P1过表达或抑制miR-545-3p表达时，RANKL的表达水平受到抑制，而OPG相反，表达出现上调。上述证据证明lncRNA SERPINB9P1通过miR-545-3p调节BMSC成骨分化。<br>　　5.miR-545-3p通过与SIRT6直接结合，调控BMSC成骨分化<br>　　为确定miR-545-3p与SIRT6之间的相互作用，在用miR-545-3p模拟物或抑制剂转染后评估SIRT6的相对表达。我们发现miR-545-3p的过表达或敲低分别导致SIRT6的下调或上调。我们还发现由SIRT6WT驱动的荧光素酶活性被miR-545-3p模拟物显著地减弱。该结果表明miR-545-3p可以与SIRT6直接结合。为确定miR-545-3p对骨髓基质细胞成骨分化的影响是否由SIRT6介导，用miR-545-3p模拟物和oe-SIRT6处理骨髓间充质细胞。发现过度表达miR-545-3p导致SIRT6蛋白表达下降，而过表达SIRT6可以抵消SIRT6蛋白表达的下降。随后，我们评估了细胞成骨分化的能力。与对照细胞相比，miR-545-3p过表达导致ALP和茜素红S染色面积减少，并且这种现象在oe-SIRT6感染后被阻断。ALP活性测定表明，miR-545-3p模拟物降低了ALP活性，SIRT6过表达可以挽救ALP活性的降低。WB结果显示，miR-545-3p过表达后SIRT6的表达水平降低。随之，ALP、OCN和RUNX2的表达量也下降，而通过过表达SIRT6则可以逆转这一过程。这些表明，miR-545-3p通过SIRT6调控BMSC成骨分化。<br>　　6.LncRNA SERPINB9P1通过miR-545-3p调控SIRT6介导BMSC成骨分化<br>　　RT-PCR显示，在敲低LncRNA SERPINB9P1后，SIRT6的表达水平下调，同时抑制miR-545-3p的表达后，该效应被削弱；蛋白免疫印迹实验显示，敲低LncRNA SERPINB9P1引起SIRT6蛋白表达下调，而在sh-LncRNA SERPINB9P1+miR-545-3p inhibitor共转染组，miR-545-3p抑制物可以挽救SIRT6蛋白表达下调。以上结果进一步验证了LncRNA SERPINB9P1通过miR-545-3p调控SIRT6介导BMSC成骨分化。<br>　　结论：<br>　　1.LncRNA SERPINB9P1于BMSC成骨分化过程中过表达，而miR-545-3p表达受抑制。<br>　　2.LncRNA SERPINB9P1下调抑制BMSC成骨分化。<br>　　3.LncRNA SERPINB9P1通过miR-545-3p调控SIRT6介导的BMSC成骨分化。