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摘要【目的】<br>　　脊髓损伤（Spinalcordinjury，SCI）具有高致残率，高致死率等特点，被认为是一种严重的创伤性神经系统疾病。脊髓损伤急性期局部组织破裂出血，导致神经元凋亡、轴突退变和脱髓鞘等一系列病理变化。而以持续炎症反应为代表的继发性损伤在脊髓损伤的亚急性期起到重要作用。成年斑马鱼在脊髓完全横断损伤后，其运动功能最终能够恢复到损伤前水平，显示出独特的中枢神经再生能力，是研究脊髓损伤后神经修复机制的理想动物模型。脊髓损伤的亚急性期是斑马鱼运动功能恢复的关键阶段。在这一时期损伤中心出现神经胶质瘢痕桥接，神经干细胞分化，轴突再生等神经修复过程。本课题组基于模式动物成年斑马鱼脊髓损伤亚急性期的mRNA转录组数据，筛选出脊髓损伤修复的关键基因。应用实时定量PCR（RT-qPCR）验证脊髓损伤后关键基因的表达变化，通过寻找脊髓损伤亚急性期的潜在干预靶点，为修复脊髓损伤提供分子病理依据。<br>　　【方法】<br>　　1.实验动物与脊髓损伤模型构建:本实验使用6月龄的成年斑马鱼20条，随机分为2组，每组10条。其中A组为脊髓损伤组，B组为假手术组。将待手术的成年斑马鱼浸没在磷酸盐缓冲液（PBS）配制的0.033％氨基苯甲酸乙基甲基酯中麻醉3-5分钟。拔除头侧第4鳞片后做一约2mm长纵向切口，暴露脊髓。在距脑干/脊髓过渡连接点的尾端约4mm处用剪刀迅速完全切断脊髓。假手术组仅进行脊髓暴露手术而不进行脊髓损伤。在损伤后第3、7、14天分别记录5分钟内斑马鱼游泳路径，应用ImageJ软件进行运动功能评价。<br>　　2.成年斑马鱼脊髓损伤后mRNA转录组学分析:本课题组从GeneExpressionOmnibus（GEO）数据库下载原始GSE77025数据集。该数据集包含2组成年斑马鱼脊髓完全横断损伤14天的脊髓样本和2组假手术组脊髓样本。本实验首先应用DESeq2（1.26.0版）软件筛选了脊髓损伤后的显著性差异表达基因，并通过HeatmapR软件包绘制出410个差异基因表达热图。随后，利用Metascape对差异表达显著性最高的50个核心基因进行了GO富集和KEEG通路分析，筛选出calb2b，sptan1，map4l，stmn2a，clasp2,ache，h1m和ddx3xb等关键基因。<br>　　3.RT-qPCR验证脊髓修复的关键基因:本实验首先制备了成年斑马鱼的损伤脊髓节段制备组织匀浆，使用EastepRNA提取试剂盒从成年斑马鱼的脊髓损伤节段提取RNA。然后利用TransScriptFirst-StandcDNA合成试剂盒反转录总RNA。随后应用TransStartGreenPCRSuperMix进行RT-qPCR以验证斑马鱼脊髓修复的关键基因。<br>　　4.脊髓损伤后蛋白质互作网络分析:本实验为了进一步了解关键基因调节脊髓损伤后神经修复的具体分子机制，使用STRING数据库以关键基因为中心构建了蛋白质相互作用网络，预测了关键基因促进脊髓损伤修复的作用通路，提出了潜在的脊髓损伤后神经修复新靶点。<br>　　【结果】<br>　　1.本课题组在成年斑马鱼脊髓完全横断损伤后的第3天，第7天和第14天评估其运动功能恢复。结果表明，斑马鱼在脊髓损伤后第14天时，损伤组斑马鱼的运动功能得到明显恢复。因此本课题组确定脊髓损伤后的亚急性期为斑马鱼神经修复的关键时期。<br>　　2.本课题组选取了脊髓损伤后第14天的mRNA转录组数据库进行分析，共筛选出了7762个成年斑马鱼脊髓损伤差异表达基因（DEG），包括2950个上调差异表达基因和4812个下调差异表达基因。在GO富集分析中，上调基因主要富集在呼吸链，突触形成，神经元，细胞和线粒体形态以及Ca2+结合等相关通路中。而下调基因主要集中在RNA加工，DNA代谢，染色体聚集和细胞周期过程中。在KEGG通路分析中，上调基因的信号通路主要富集在氧化磷酸化，NADH脱氢酶（泛醌）通路和细胞内吞作用。下调的差异基因主要富集在RNA转运，内质网蛋白质加工以及细胞周期调控等通路。通过分析脊髓损伤后主要差异基因在GO功能通路的分布，本课题组发现calb2b，sptan1，map4l，stmn2a，clasp2和ache至少富集在3个关键的神经修复或线粒体功能调控通路上，h1m和ddx3xb均参与了4个与神经细胞发育周期相关的重要通路，提示这些基因在神经干细胞分化和轴突再生中参与了多种关键生物学过程，其中线粒体功能调控可能是脊髓损伤的潜在修复策略。<br>　　3.本课题组利用RT-qPCR验证成年斑马鱼脊髓损伤后calb2b，sptan1，Map41，stmn2a，ache，h1m和ddx3xb的表达变化。RT-qPCR结果证实，脊髓损伤后clasp2较假手术组上调至1.46倍，h1m较假手术组下调至0.46倍，具有统<br>　　计学意义，其表达变化与RNA-seq转录组数据趋势一致。此外，实验验证脊髓损伤后sptan1和stmn2a表达水平较对照组没有显著性差异，而calb2b，map4l和ache分别下调至假手术组的0.48、0.33和0.62倍。蛋白互作网络（PPI）分析提示，Clasp2可能通过与Ckap5和Pafah1b1a相互作用促轴突再生，而Pafah1b1a则与微管和轴突线粒体运输有关。H1m与Nanog基因相互作用，可能具有促进内源性神经干细胞的分化的功能。<br>　　【结论】<br>　　1.本实验构建模式生物斑马鱼脊髓损伤模型，发现脊髓完全横断损伤后第14天斑马鱼的运动功能有显著恢复。因此本课题组确定了亚急性期为斑马鱼脊髓损伤恢复的关键时期。<br>　　2.本实验利用成年斑马鱼脊髓损伤的mRNA转录组数据成功分析了脊髓损伤亚急性期的差异表达基因。筛选出calb2b，sptan1，Map41，stmn2a，ache，h1m和ddx3xb等与脊髓损伤修复相关的关键基因。通过GO功能通路富集和KEEG通路分析发现脊髓损伤后上调的关键基因主要参与了神经元相关通路和线粒体调控通路等关键生物学过程。下调的基因主要集中在RNA加工，DNA代谢过程，染色体聚集和细胞周期过程中。分析结果证实了这些基因可能是脊髓损伤后神经修复的关键靶点，加强线粒体功能调控功能可能是脊髓损伤潜在的修复策略。<br>　　3.本实验利用RT-qPCR验证了脊髓损伤修复的关键基因clasp2或h1m，并以关键基因为中心进行了蛋白互作用网路（PPI）分析，提出了Clasp2和H1m促进脊髓损伤后神经修复的机制，探讨脊髓损伤亚急性期微环境中差异表达基因的作用通路，为修复脊髓损伤提供了分子病理依据。