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摘要目的<br>　　在全球范围内，肝癌的发病率和死亡率位居世界第二，肝细胞癌是全球最为常见的肝癌类型，约占所有肝癌发病率的90%。越来越多的研究表明，恒定自然杀伤T细胞（invariantnaturalkillerT,iNKT）对肝脏免疫系统具有重要的调控作用，与肝脏疾病的发生发展密切相关。在肝细胞癌形成过程中，iNKT细胞参与小鼠机体抗肿瘤免疫监测，其具体作用机制并不完全清楚。本研究的目的是探究iNKT细胞参与肝癌形成过程中机体抗肿瘤免疫的具体机制。<br>　　方法<br>　　我们构建稳定高表达mCherry的Hepa1-6细胞株，将2×105mCherry+Hepa1-6细胞原位注射至CXCR6GFP/+小鼠肝脏左叶，构建小鼠原位肝癌模型。通过流式细胞术和共聚焦显微镜小鼠体外成像技术观察在肝癌形成早期，肝脏iNKT细胞的比例和分布变化。流式细胞术验证敲除CXCR6后iNKT细胞在肝脏中的分布是否发生改变；同时提取原代肝细胞，磁珠分选免疫细胞，将肝细胞和免疫细胞按比例混合后进行单细胞测序检测，分析CXCR6调控iNKT细胞分布发生改变即发生由肝血窦迁移至肝实质的机制。通过流式细胞术对iNKT细胞表达的活化和肿瘤细胞杀伤分子进行检测，通过共聚焦显微镜记录iNKT细胞在肝脏中的运动轨迹，并由此评估其活化状态。<br>　　通过Western-blot技术分析CXCR6配体CXCL16蛋白表达水平的变化，并根据单细胞测序的结果，找到分泌CXCL16诱导iNKT细胞在肝脏中分布发生改变的细胞，同时通过流式细胞术和免疫荧光技术进行验证。在共聚焦显微镜下记录观察iNKT细胞与肿瘤细胞的相互接触。为了进一步观察iNKT细胞由肝血窦迁移至肝实质受阻对肿瘤成瘤的影响，在CXCR6-/-小鼠中原位注射肝癌细胞2周时，观察小鼠肝脏成瘤情况；通过流式细胞术检测CXCR6+/-，CXCR6-/-小鼠肝脏iNKT细胞中肿瘤细胞杀伤分子如IFN-γ和IL-4的表达水平和肝脏中CD4+T细胞，CD8+T细胞的比例。<br>　　结果<br>　　1原位肝癌模型的构建<br>　　构建稳定表达mCherry荧光蛋白的Hepa1-6细胞，以每只小鼠2×105的量原位注射至CXCR6GFP/+小鼠肝脏中，以此实现iNKT细胞和Hepa1-6细胞的可视化。<br>　　2肝癌形成早期肝脏iNKT细胞从肝血窦迁移至肝实质中<br>　　流式细胞术和共聚焦显微镜结果显示，原位注射Hepa1-6细胞8h内，iNKT细胞在肝脏中显著招募。通过PECAM-1标记肝血窦，共聚焦显微镜结果显示，原位注射Hepa1-6细胞8h时，肝实质iNKT细胞显著募集；通过CD45-APC区分肝血窦和肝实质中的iNKT细胞，流式细胞术结果进一步验证，原位注射Hepa1-6细胞8h时，肝血窦iNKT细胞比例显著减少，肝实质iNKT细胞比例显著增加。<br>　　3CXCR6调控iNKT细胞从肝血窦迁移至肝实质<br>　　流式细胞术结果显示，iNKT细胞从肝血窦迁移至肝实质这一过程由CXCR6调控。单细胞测序结果显示，原位注射Hepa1-6细胞8h时，与CXCR6+/-小鼠相比，在CXCR6-/-小鼠中，肝脏iNKT细胞表达的免疫功能相关通路显著下调。<br>　　4肝实质iNKT细胞活化状态增强，肿瘤细胞杀伤分子表达显著增加<br>　　流式细胞术结果显示，在CXCR6+/-小鼠中，进入肝实质中的iNKT细胞表达的活化标志物和肿瘤细胞杀伤相关标志物显著提高；且在共聚焦显微镜下，肝脏中大部分iNKT细胞呈静止状态。而在CXCR6-/-小鼠中，肝实质iNKT细胞的活化分子和肿瘤细胞杀伤标志物的表达水平并未发生改变；且在共聚焦显微镜下，肝脏中的iNKT细胞仍呈现较为活跃的状态。<br>　　5肝窦状内皮细胞分泌CXCL16招募iNKT细胞进入肝实质<br>　　在CXCR6+/-小鼠中，原位注射Hepa1-6细胞8h时，肝脏中CXCR6的配体CXCL16的蛋白表达水平显著升高。单细胞测序结果显示，CXCL16富集在肝窦状内皮细胞和Kupffer细胞群体中；通过流式细胞术进一步验证，肝窦状内皮细胞显著上调CXCL16招募iNKT细胞进入肝实质。<br>　　6iNKT细胞与肿瘤细胞的相互接触促进肿瘤细胞清除<br>　　共聚焦显微镜小鼠活体成像技术记录iNKT细胞杀伤肿瘤细胞的过程，发现在CXCR6+/-小鼠肿瘤形成过程中，肿瘤细胞聚集成团且iNKT细胞在该细胞团块内呈现静止状态，团块外iNKT细胞运动相对活跃；而CXCR6-/-小鼠中，肿瘤细胞聚集成团，而在肿瘤细胞团块中并没有iNKT细胞的存在。通过流式细胞术定量检测肝脏中的肿瘤细胞，结果显示在CXCR6-/-小鼠中，原位注射Hepa1-6细胞8h时，肝脏中的肿瘤细胞数量显著高于CXCR6+/-小鼠。<br>　　7iNKT细胞迁移至肝实质受阻加快肿瘤形成并减弱CD4+T细胞和CD8+T细胞招募<br>　　原位注射肝癌细胞2周后，CXCR6-/-小鼠肝脏成瘤更加严重。通过流式细胞术检测CXCR6+/-小鼠肝脏iNKT细胞表达的肿瘤细胞杀伤分子，结果显示，随着时间的延长，iNKT细胞表达的IFN-γ和IL-4显著增加；而在CXCR6-/-小鼠中，肝脏iNKT细胞表达的IFN-γ和IL-4并没有发生改变。在原位注射肝癌细胞2周时，CXCR6+/-小鼠肝脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞均显著募集，而在CXCR6-/-小鼠中，肝脏CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例并没有发生改变。<br>　　结论<br>　　在肝细胞癌形成早期，肝脏iNKT细胞显著招募且在CXCR6调控下由肝血窦迁移至肝实质，进入肝实质的iNKT细胞活化状态显著增强，肿瘤细胞杀伤分子如NKG2D,DNAM-1,IFN-γ,IL-4的表达显著增加。在肝细胞癌形成早期，CXCR6的配体CXCL16蛋白表达水平显著增加，且肝窦状内皮细胞上调CXCL16的分泌招募肝血窦iNKT细胞进入肝实质。进入肝实质中的iNKT细胞与肿瘤细胞相互接触，发挥抗肿瘤免疫功能。在原位注射肿瘤细胞2w时，iNKT细胞迁移至肝实质受阻后，肝脏iNKT细胞表达的肿瘤细胞杀伤分子并不发生改变，肝脏CD4+T细胞和CD8+T细胞招募显著受阻，小鼠肝脏肿瘤进展更加严重。