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摘要研究背景：酒精性肝炎（Alcoholichepatitis,AH）是长期饮酒导致的肝脏损伤性疾病,属于酒精性肝病的早期阶段，也是临床干预治疗的重点。虽然经过了多年的研究，临床上仍缺乏有效的方法来阻止或逆转AH。肝脏巨噬细胞（即kupffer细胞）的持续过度活化对诱导和推动AH都具有举足轻重的作用。近年来的研究显示，外泌体可直接激活AH中肝脏巨噬细胞，是巨噬细胞过度活化的重要因素。抑制外泌体的生成，降低巨噬细胞活化程度，可以减轻AH中肝脏过度的炎症反应，是治疗AH的重要研究方向。<br>　　目的：鹿仙草是蛇菰科蛇菰属筒鞘蛇菰（BalanophorainvolucrataHook.f.,BP）及其近似植株的全草，在民间作为民族药长期使用。本课题旨在研究鹿仙草的提取物鹿仙草多糖（Balanophorapolysaccharide,BPP）对AH的应用及其可能的机制，为鹿仙草多糖的进一步开发和应用提供实验依据。<br>　　方法：C57BL/6N小鼠用Lieber-DeCarli饮食喂养以建立慢性AH小鼠模型。造模期间，饮食对照组小鼠给与对照液体饲料，其余组别给与酒精液体饲料，酒精浓度为5%（体积/体积），饲料当天配置，每日记录小鼠进食量和体重变化。无特定病原体（specificpathogenfree，SPF）级C57BL/6雄性小鼠（20-22g），随机分为液体饮食对照组（PF）、酒精液体饮食模型组（AF）、酒精液体饮食+鹿仙草多糖低剂量组（AF+BPP-L）、酒精液体饮食+鹿仙草多糖高剂量组（AF+BPP-H），每组12只。药物作用组分别以200mg/kg、400mg/kg鹿仙草多糖灌胃，其余组别小鼠分别给予相应体积的药物溶剂0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），每日一次，持续给药4周。<br>　　末次给药结束后眼球取血处死小鼠，观察以下指标：1）肝脏组织苏木精-伊红（Hematoxylin-eosinstaining,HE）染色与油红O染色检测小鼠肝脏受损与脂质沉积情况；2）生化酶法检测小鼠血清中谷丙转氨酶（Alaninetransaminase,ALT）和肝脏组织总胆固醇（Totalcholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyccride,TG）的含量；3）Real-timePCR检测肝脏组织中炎症因子、脂合成相关基因以及miR-155的表达情况；4）WesternBlot检测自噬相关蛋白，如雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）、脑中富含ras同系物（Rashomologenrichedinbrain,Rheb）、选择性自噬接头蛋白（Sequestosome1,p62/SQSTM1）的表达情况。检测溶酶体相关膜蛋白，如溶酶体相关膜蛋白1（RecombinantLysosomalAssociatedMembraneProtein1,LAMP1）、溶酶体相关膜蛋白2（RecombinantLysosomalAssociatedMembraneProtein2,LAMP2）的表达情况；检测肝脏组织重组分化簇40配体（Recombinantclusterofdifferentiation40ligand,CD40L）的表达情况；5）免疫组化和免疫荧光分别检测肝脏组织CD40L和CD63的表达；6）通过透射电镜和纳米粒子跟踪分析（nanoparticletrackinganalysis,NTA）技术对外泌体的粒子直径、浓度和表面标记物进行鉴定和分析。<br>　　细胞实验采用AML-12细胞建立肝细胞酒精损伤模型，并分别加入100μg/mL、200μg/mL鹿仙草多糖进行干预。THP-1细胞在RPMI-1640完全培养基中培养，经5μg/mL佛波酯（phorbolmyristateacetate,PMA）刺激12h，形成PMA分化的THP-1细胞（pd-TPH-1）。收集正常以及酒精刺激后的AML-12细胞外泌体，经外泌体荧光染料PKH26标记后与pd-TPH-1细胞共培养。观察以下指标：1）检测AML-12细胞miR-155表达水平和pd-TPH-1炎性相关因子的表达；2）Westernblot检测AML-12细胞溶酶体相关蛋白LAMP1、LAMP2以及外泌体相关蛋白CD40L的表达；3）PKH26标记外泌体，荧光显微镜观察pd-TPH-1细胞外泌体的摄入情况；4）透射电镜和纳米粒子跟踪分析技术对外泌体的粒子直径、浓度和表面标记物进行了鉴定分析。<br>　　结果：鹿仙草多糖有效的保护了AH小鼠的肝脏损伤：1）与对照饮食组小鼠相比，HE染色与油红O染色结果显示酒精饮食模型组小鼠有严重的肝损伤和脂质沉积，且在鹿仙草多糖干预后，肝损伤和脂质沉积有明显减轻；2）酒精饮食模型组经鹿仙草多糖干预后，血清ALT及肝脏TC、TG含量有明显下降，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；3）与对照饮食组相比，酒精饮食组肝脏组织炎症及巨噬细胞活化相关相关指标（如：TNF-α,IL-1β,NLRP3,MCP-1等）及脂合成相关基因（如：SREBP1c,Fasn等）的表达明显上升，经鹿仙草多糖干预后有明显下降（Plt;0.05）。<br>　　鹿仙草多糖显著改善了AH小鼠肝脏细胞自噬损伤，抑制肝脏外泌体的生成：1）酒精饮食组小鼠经鹿仙草多糖干预后，肝脏miR-155的表达显著降低（Plt;0.05）；2）酒精饮食组小鼠肝脏组织经鹿仙草多糖干预后，LAMP1、LAMP2明显升高，p62明显下降（Plt;0.05）。3）与PF组相比，AF组小鼠肝脏组织中CD40L的表达明显上升，鹿仙草多糖干预后，酒精饮食小鼠肝脏组织CD40L的表达下降；4）酒精摄入导致小鼠肝脏组织中外泌体的数量显著增加，鹿仙草多糖干预后数量减少，具有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　鹿仙草多糖降低了酒精诱导的AML-12细胞自噬损伤和外泌体生成的增加：1）鹿仙草多糖显著的抑制了酒精诱导的AML-12细胞中miR-155表达水平的升高；2）与对照组相比，酒精抑制了AML-12细胞中LAMP1、LAMP2的表达，鹿仙草多糖则可以逆转这一作用（Plt;0.05）。3）与对照组相比，酒精组AML-12细胞外泌体的数量显著增加，在鹿仙草多糖干预后，外泌体数量减少（Plt;0.05）；4）在与酒精刺激AML-12细胞的外泌体共培养后，pd-TPH-1细胞的炎性因子TNF-α、IL-1β的表达显著升高，与此相比，经鹿仙草多糖干预后生成的外泌体与pd-TPH-1细胞共培养后，其炎性因子的表达显著降低（Plt;0.05）。<br>　　结论：1）鹿仙草多糖能有效的抑制酒精导致的肝脏炎症反应，减少肝脏的脂质沉积，改善慢性AH小鼠的肝损伤；2）鹿仙草多糖可以有效降低酒精诱导的肝脏外泌体-CD40L生成的增加，抑制肝脏巨噬细胞活化，改善肝脏过度的炎性反应；3）鹿仙草多糖可以抑制酒精诱导的肝细胞miR-155表达，提高自噬溶酶体功能，从而抑制外泌体的分泌。