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摘要柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3,CVB3）属Picornaviridae病毒科，肠病毒属，是引起病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和胰腺炎的重要病原体。然而，目前临床上治疗CVB3感染的策略十分有限。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）是RNA分子中最普遍的化学修饰，可通过调节mRNA及其编码蛋白的表达来影响基因功能。m6A甲基化修饰的宿主细胞转录本在调节病毒复制和传染性方面有重要作用，但其在CVB3感染期间扮演的角色尚不清楚。<br>　　目的：<br>　　为阐明m6A修饰的宿主转录本对CVB3感染的重要性，本研究以CVB3感染后m6A修饰水平显著差异的基因LONP1为研究对象，拟在HeLa细胞（CVB3易感细胞系）内分析病毒感染期间LONP1m6A修饰动态变化的分子机制及其对转录表达的调节作用；并初步探讨m6A修饰的LONP1对CVB3复制的影响及作用机制，为CVB3感染的诊断和治疗提供新的理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.利用RNA甲基化免疫共沉淀-高通量测序（Methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq）技术筛选CVB3感染后m6A修饰水平显著差异的宿主转录本—LONP1，并用SRAMP数据库对LONP1的潜在m6A修饰位点进行定位，随后通过RNA甲基化免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶链反应（Methylated RNA immunoprecipitation-quantitative real time polymerase chain reaction,MeRIP-qRT-PCR）实验验证LONP1mRNA的m6A修饰情况以及CVB3感染前后LONP1的m6A水平变化；同时分析CVB3感染前后LONP1的转录表达变化。<br>　　2.构建LONP1野生型（LONP13''UTR WT）及m6A位点突变型（LONP13''UTR m6A-Mut）双荧光素酶载体，分析CVB3感染期间LONP1m6A甲基化修饰位点对其转录表达的调节作用。<br>　　3.通过western blot、qRT-PCR、MeRIP-qRT-PCR和双荧光素酶实验综合分析CVB3感染期间m6A相关蛋白介导LONP1甲基化修饰及转录表达的机制。<br>　　4.通过RIP-qRT-PCR、qRT-PCR和western blot方法筛选与LONP1mRNA结合的m6A甲基化阅读蛋白，并利用放线菌素D（5μg/mL）分析CVB3感染对LONP1mRNA和蛋白稳定性的影响，探讨病毒感染期间m6A修饰调控LONP1转录表达的作用机制。<br>　　5.过表达/沉默LONP1，通过细胞病变观察实验、western blot、病毒噬斑实验和荧光病毒实验分析LONP1对CVB3复制增殖的调控作用。<br>　　6.利用western blot实验、细胞内铁离子含量测定试剂盒、ROS含量测定试剂盒分析CVB3感染期间LONP1对相关铁死亡指标的影响，进一步探讨LONP1影响CVB3复制及宿主细胞病变的分子机制。<br>　　结果：<br>　　1.LONP13''UTR区（2946bp处）存在高可信度的m6A修饰位点，CVB3感染导致LONP1mRNA的m6A修饰水平显著下降（Plt;0.05）；LONP1的mRNA及蛋白表达水平在CVB3感染7h时明显升高（Plt;0.05）。<br>　　2.CVB3感染可显著上调LONP13''UTR WT的荧光素酶活性（Plt;0.05），但对于LONP13''UTR m6A-Mut的荧光素酶活性无明显影响（Pgt;0.05）。<br>　　3.CVB3感染显著抑制了甲基化酶WTAP的表达（Plt;0.05）；沉默WTAP会降低LONP1的m6A水平，升高LONP1的蛋白和mRNA水平，且荧光素酶实验显示沉默WTAP可显著上调LONP13''UTR WT的荧光素酶活性（Plt;0.05），但对于LONP13''UTR m6A-Mut的荧光素酶活性无明显影响（Pgt;0.05）；CVB3感染增加了LONP1表达，但在CVB3感染的同时过表达WTAP则可使LONP1基本恢复到未感染时的水平。<br>　　4.m6A修饰的LONP1mRNA可结合甲基化阅读蛋白YTHDF2；CVB3的感染增强了LONP1的稳定性，减缓了其在ActD处理时的衰变速率（Plt;0.05）。<br>　　5.LONP1过表达可减轻CVB3所致的细胞病变，并抑制CVB3VP1表达和噬斑形成，减弱CVB3-eGFP的荧光强度（Plt;0.05）；而LONP1沉默则会加重CVB3所致的细胞病变，促进CVB3VP1表达和噬斑形成，同时增强CVB3-eGFP的荧光强度（Plt;0.05）。<br>　　6.在CVB3感染期间，过表达LONP1促进了铁死亡抑制基因GPX4的表达，抑制了铁死亡促进基因ACSL4的表达，同时降低细胞内铁离子含量和ROS含量（Plt;0.05）；沉默LONP1则抑制了GPX4的表达，促进了ACSL4的表达，同时增加了细胞内铁离子含量和ROS含量（Plt;0.05）。<br>　　结论：<br>　　WTAP介导的m6A修饰调节LONP1的稳定性，导致其在CVB3感染期间转录表达增加，表达增加的LONP1对细胞铁死亡和CVB3复制有抑制作用，这可能是一种由宿主启动的抵御病毒感染的自我保护机制。