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摘要目的：<br>　　本研究旨在探讨甲基转移酶3（METTL3）介导的m6A甲基化修饰对滤泡辅助性T（Tfh）细胞功能的影响，寻找其作用的靶分子，并观察其在胶原诱导性关节炎（CIA）疾病进程中的作用。<br>　　方法：<br>　　（1）检测CIA小鼠和类风湿性关节炎患者Tfh细胞比例及METTL3水平变化<br>　　制备牛II型胶原（CII）和弗氏佐剂油包水乳剂，尾根部注射DBA1/J小鼠，构建CIA小鼠模型并鉴定。流式细胞术（FCM）检测CIA小鼠Tfh细胞比例及Tfh细胞内METTL3的表达，同时检测GCB细胞（CD19+Fas+GL-7+）及骨髓浆细胞（B220-CD138+）比例变化。酶联免疫吸附试验（ELSIA）检测CIA小鼠血清中抗CII特异性IgG（抗CII-IgG）水平变化。<br>　　利用磁珠法分选CIA小鼠脾脏Tfh细胞（CD4+CXCR5+），比较CIA小鼠和佐剂对照小鼠脾脏Tfh细胞的m6A水平。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测m6A甲基化酶METTL3和METTL14的mRNA水平。<br>　　FCM检测类风湿性关节炎（RA）患者外周血中Tfh细胞比例及Tfh细胞中METTL3的表达情况。<br>　　（2）研究Tfh细胞对CIA小鼠疾病发生发展的影响<br>　　CIA造模过程中第18天和25天，通过尾静脉过继转移1×106/只Tfh细胞和非Tfh（CD4+CXCR5-，non-Tfh）细胞至CIA小鼠体内，以PBS组作为空白对照组。观察小鼠足趾关节肿胀程度并记录各组小鼠的关节评分。于免疫第43天处死小鼠，制备关节组织病理切片。苏木精-伊红染色法（HE）染色并观察病理学改变。FCM检测小鼠脾脏和腘窝淋巴结中GCB细胞比例及骨髓浆细胞比例，ELSIA检测CIA小鼠血清中抗CII-IgG水平。<br>　　（3）探究Tfh细胞内METTL3表达对CIA小鼠疾病进展的影响<br>　　为了解Tfh细胞内METTL3表达在CIA疾病进展中作用，利用磁珠联合流式细胞仪分选Tfh细胞（CD4+CXCR5+GITR-CD19-），采用METTL3特异性小干扰（siRNA）转染Tfh细胞，过继转移TfhsiNC和TfhsiMETTL3到CIA小鼠体内，以PBS组作为空白对照组,对各组别的小鼠进行关节评分，观察关节病理学改变，检测血清中抗CII-IgG水平，amp;nbsp;FCM检测小鼠脾脏和腘窝淋巴结中GCB细胞比例及骨髓浆细胞比例。<br>　　（4）探究METTL3抑制剂STM2457对CIA小鼠疾病进展的影响<br>　　CIA造模过程中第18、25、32、39天，通过腹腔注射METTL3抑制剂STM2457（50mg/kg）和等量溶剂对照DMSO至CIA小鼠体内，以不做任何干预CIA组作为空白对照组。观察小鼠足趾关节肿胀程度并记录各组小鼠的关节评分。于免疫第43天处死小鼠，制备关节组织病理切片，HE染色并观察病理学改变。FCM检测小鼠脾脏、腘窝淋巴结Tfh、GCB细胞比例，以及脾脏和骨髓浆细胞比例，ELSIA检测CIA小鼠血清中抗CII-IgG水平。<br>　　（5）探究METTL3调控Tfh细胞介导B细胞分化和抗体产生的作用<br>　　采用卵清白蛋白（OVA）免疫小鼠，磁珠分选Tfh细胞，分别采用siRNA,METTL3特异性抑制剂STM2457和METTL3慢病毒过表达载体转染处理Tfh细胞，利用qRT-PCR、FCM和蛋白质免疫印迹分析Tfh细胞功能分子的mRNA和蛋白表达水平变化。<br>　　磁珠分选CD19+B淋巴细胞，分别与TfhsiMETTL3,TfhSTM2457和TfhpLV-METTL3细胞共培养72h，FCM检测共培养体系中GCB和浆母细胞（CD138+）比例，ELISA检测共培养上清中抗OVA抗体水平。<br>　　（6）探讨METTL3调控CD40L表达的分子机制<br>　　利用NCBI检索小鼠CD40LmRNA序列，并用SRAMP数据库对CD40LmRNA序列进行预测是否存在m6A修饰位点。RNA甲基化免疫共沉淀（MeRIP-qPCR）检测CD40LmRNA上m6A水平。利用RIP实验进行富集与METTL3结合的mRNA，qRT-PCR检测CD40LmRNA的表达水平。使用放线菌素D阻断CD40LmRNA合成，分别检测敲减METTL3和过表达METTL3后细胞中CD40LmRNA稳定性的变化。qRT-PCR筛选出与mRNA稳定性相关的阅读蛋白IGF2BP3。采用RIP-qPCR检测IGF2BP3是否能与CD40LmRNA结合。此外，敲减IGF2BP3后检测CD40L的表达及mRNA稳定性的变化。<br>　　（7）观察IL-21/STAT3信号对METTL3表达和m6A变化的影响<br>　　FCM检测CIA小鼠不同时期脾脏和淋巴结Tfh细胞IL-21表达水平。体外培养Tfh细胞，加入外源性IL-21蛋白，qRT-PCR和WesternBlot检测Tfh细胞中METTL3表达，斑点印迹法检测m6A整体水平变化。<br>　　WesternBlot检测IL-21刺激对Tfh细胞STAT3磷酸化水平影响，使用STAT3磷酸化抑制剂Stattic或抗IL-21中和抗体分别处理Tfh细胞，WesternBlot检测STAT3磷酸化以及METTL3蛋白水平变化。<br>　　此外，采用ChIP实验验证STAT3能否与METTL3的转录启动子区域结合。<br>　　结果：<br>　　（1）CIA小鼠体内Tfh细胞比例明显增加<br>　　与佐剂对照组小鼠相比，CIA小鼠足趾明显红肿，关节的临床评分显著增高，血清抗CII-IgG水平显著升高（Plt;0.001），关节间隙炎性细胞浸润增多。表明成功构建了CIA小鼠模型。FCM结果显示佐剂对照组脾脏Tfh细胞为3.30±1.08%，淋巴结Tfh细胞为0.79±0.34%；CIA小鼠脾脏Tfh细胞为5.17±0.59%，淋巴结Tfh细胞分别为3.83±0.32%。结果显示，CIA小鼠脾脏和淋巴结中Tfh细胞比例显著升高。与此同时，进一步检测脾脏和淋巴结中GCB细胞比例，脾脏和骨髓中浆细胞比例，FCM结果显示CIA小鼠GCB细胞比例显著增加。这些结果表明，CIA小鼠体内Tfh比例明显增加，B细胞介导的体液免疫功能增强。<br>　　（2）Tfh细胞能加速CIA小鼠疾病进展<br>　　为进一步探究Tfh细胞对CIA疾病的影响，将Tfh细胞过继转移到CIA小鼠，观察疾病进展情况。与non-Tfh细胞组小鼠相比，Tfh细胞组小鼠足趾肿胀更为明显，小鼠血清中抗CII-IgG水平明显升高（Plt;0.05）。FCM结果显示Tfh细胞组小鼠脾脏和淋巴结GCB细胞比例为1.11±0.08%、3.59±0.48%，non-Tfh组小鼠脾脏和淋巴结GCB细胞比例为0.72±0.29%、1.22±0.52%，PBS组小鼠脾脏和淋巴结GCB细胞比例为0.49±0.14%、0.55±0.02%。结果显示Tfh过继转移能明显增加CIA小鼠体内GCB细胞比例。此外，过继转移Tfh、non-Tfh细胞和PBS组小鼠脾脏浆细胞比例分别为0.71±0.02%、0.46±0.13%、0.39±0.04%，骨髓浆细胞比例分别为0.73±0.09%、0.49±0.04%、0.34±0.02%，FCM结果显示过继转移Tfh细胞组小鼠浆细胞也明显增高。上述结果表明过继转移Tfh细胞显著促进小鼠体内B细胞免疫应答，加速CIA小鼠疾病进展。<br>　　（3）CIA小鼠Tfh细胞和RA患者外周血Tfh细胞的METTL3表达显著升高<br>　　CIA小鼠Tfh细胞中m6A水平是对照组的2.1倍，Tfh细胞METTL3的表达水平显著升高（Plt;0.05），但METTL14的mRNA表达无明显差异。结果表明在CIA小鼠疾病状态下，Tfh细胞m6A水平和METTL3表达显著升高。<br>　　此外，FCM检测结果显示RA患者外周血中Tfh细胞比例为3.30±1.81%，健康对照者为1.36±0.59%；RA患者和健康对照组Tfh细胞内METTL3的平均荧光强度分别2872±762.1和1886±302.2。这些结果表明RA患者的Tfh细胞比例和METTL3表达水平也显著高于健康对照者。<br>　　（4）敲减METTL3后Tfh细胞介导的CIA小鼠体内B细胞免疫应答能力下降<br>　　敲减Tfh细胞的METTL3后，过继转移TfhsiMETTL3细胞组CIA小鼠的发病率、临床评分以及血清抗CII-IgG水平明显低于TfhsiNC对照组（Plt;0.05）。FCM分析结果显示，TfhsiNC组脾脏GCB细胞、淋巴结GCB细胞、脾脏浆细胞和骨髓浆细胞比例分别为1.20±0.43%、2.37±0.98%、0.32±0.05%以及0.61±0.13%，TfhsiMETTL3组脾脏GCB细胞、淋巴结GCB细胞、脾脏浆细胞和骨髓浆细胞比例分别为0.67±0.17%、1.23±0.39%、0.32±0.74%以及0.47±0.08%，PBS组脾脏GCB细胞、淋巴结GCB细胞、脾脏浆细胞和骨髓浆细胞0.74±0.18%、0.63±0.22%、0.31±0.10%、0.27±0.13%，TfhsiMETTL3组小鼠体内GCB细胞比例明显低于TfhsiNC对照组。这些结果表明，敲减METTL3后，Tfh细胞介导的CIA小鼠体内B细胞免疫应答能力下降。<br>　　（5）STM2457体内干预CIA小鼠疾病进展<br>　　进一步使用METTL3抑制剂STM2457体内干预CIA小鼠，结果发现，与DMSO对照小鼠相比，STM2457处理后CIA小鼠的足趾肿胀程度减弱，临床评分显著降低，血清中抗CII-IgG水平明显降低（Plt;0.001）。FCM结果显示，与DMSO组相比，STM2457组小鼠脾脏和淋巴结中Tfh细胞的比例显著降低，骨髓浆细胞比例也明显降低。<br>　　以上结果表明抑制METTL3能显著降低Tfh细胞比例，进而延缓CIA小鼠疾病进展。<br>　　（6）METTL3调控Tfh细胞功能，促进B细胞分化和抗体产生<br>　　在Tfh和B细胞共培养体系中，与对照组（TfhsiNC或TfhDMSO）相比，敲减METTL3或STM2457处理的Tfh细胞组中GCB细胞比例、浆母细胞比例以及IgG分泌水平显著降低；而TfhpLV-METTL3组促进B细胞分化和抗体产生能力显著高于对照组。<br>　　在Tfh细胞体外培养体系中，分别用METTL3抑制剂STM2457和siRNA处理Tfh细胞。结果发现，STM2457能明显抑制Tfh细胞功能分子CD40L和IL-21的mRNA表达。与对照组TfhsiNC相比，TfhsiMETTL3组CD40L和IL-21mRNA水平显著下降，CD40L蛋白水平明显降低。但是，无论是STM2457或siRNA处理，Tfh细胞分泌的IL-21含量都无明显变化。当过表达METTL3后，Tfh细胞CD40L的mRNA和蛋白水平显著升高。<br>　　此外，在共培养体系中反向阻断CD40L，结果显示共培养体系中GCB细胞比例、浆母细胞比例以及IgG分泌水平显著降低；而在TfhsiMETTL3与B细胞共培养体系中添加CD40L重组蛋白，TfhsiMETTL3细胞辅助B细胞分化为GCB细胞和产生IgG抗体的能力得到部分恢复。<br>　　上述结果表明，METTL3可增加Tfh细胞中CD40L的表达，促进B细胞分化和抗体产生。<br>　　（7）METTL3介导的m6A修饰增强CD40LmRNA稳定性<br>　　根据SRAMP数据库预测CD40LmRNA存在m6A修饰位点，并利用MeRIP-qPCR实验得到验证。MeRIP-qPCR结果显示，与siRNA对照组相比，敲减METTL3后，CD40LmRNA上m6A水平显著降低。<br>　　使用转录抑制剂放线菌素D，qRT-PCR进行mRNA半衰期检测。结果显示与对照组相比，si-METTL3组细胞的CD40LmRNA半衰期减少32%，pLV-METTL3组CD40LmRNA半衰期显著增加，表明METTL3可以提高CD40LmRNA稳定性。RIP-qPCR结果显示，METTL3可以直接结合CD40L。由于阅读蛋白IGF2BPs家族参与mRNA稳定性，经过qPCR筛选出Tfh细胞中IGF2BP3分子表达含量最高。RIP-qPCR结果显示细胞中IGF2BP3与CD40LmRNA直接结合，增强CD40LmRNA稳定性。与siRNA对照组相比，敲减METTL3后，IGF2BP3结合CD40LmRNA水平显著降低。结果表明METTL3通过m6A-IGF2BP3方式增强CD40LmRNA稳定性。<br>　　（8）IL-21/STAT3信号促进Tfh细胞METTL3表达<br>　　IL-21是维持Tfh细胞功能的关键因子，FCM分析显示CIA小鼠脾脏和淋巴结Tfh细胞表达的IL-21水平显著高于佐剂对照组。IL-21体外刺激Tfh细胞后，METTL3表达及m6A水平显著升高。进一步分析发现，IL-21可增强Tfh细胞STAT3分子的磷酸化水平；STAT3抑制剂Stattic处理后，Tfh细胞中METTL3表达下降；抗IL-21的中和抗体预处理后，Tfh细胞中METTL3表达下降，STAT3磷酸化水平降低。ChIP-qPCR结果显示STAT3可以直接结合在METTL3转录启动子区上游（即1418-1624bp区域）；而抗IL-21的中和抗体处理后，STAT3和METTL3转录启动子区上游1418-1624bp的结合受到抑制。<br>　　以上结果证实，IL-21/STAT3信号可以促进Tfh细胞内METTL3表达。<br>　　结论：<br>　　CIA小鼠疾病进程中，IL-21/STAT3可促进Tfh细胞中METTL3的表达，METTL3通过m6A-IGF2BP3方式增强CD40LmRNA稳定性，进而上调CD40L的表达，促进B细胞分化和抗体产生，加剧CIA小鼠疾病进展。