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翡翠湖与尕海嗜盐古菌多样性及其硝酸盐还原酶研究

摘要腌制蔬菜的食品安全问题一直是人们关注的焦点。市售腌制蔬菜中的亚硝酸盐含量虽然已符合国家标准,但其中残存的硝酸盐含量仍然很高。这些残存的硝酸盐被食入后在人体胃肠道内被还原为亚硝酸盐,带来潜在的致病风险。酶降解法具有专一性和高效性,是降解腌制蔬菜中硝酸盐的首选方法,然而,普通的酶在较高盐度下容易失活,亟待寻找能在高盐条件下发挥活性的硝酸盐还原酶。本研究采用免培养和可培养技术,研究翡翠湖和尕海嗜盐古菌多样性;对嗜盐古菌新类群进行多相分类学研究,确定其分类学地位;从嗜盐古菌新类群的基因组,挖掘硝酸盐还原酶基因,进而通过表达和纯化获得硝酸盐还原酶,进一步表征,以期为硝酸盐还原酶的进一步开发应用提供依据。<br>  高通量测序结果表明,翡翠湖的古菌多样性高于尕海。翡翠湖的优势属级分类单元为Halorubrum和Halolamina,占比均为18.8%;尕海的优势属级分类单元为Halorubrum,占比为55.4%。通过可培养技术从翡翠湖共分离出85株嗜盐古菌,分属于10个属的20个种级分类单元,其中优势属级分类单元为Halalkalicoccus和Halorubrum,分别占总菌株数的32.9%和31.8%;从尕海中分离出108株嗜盐古菌,分属于12个属的27个种级分类单元,其中优势属级分类单元为Halorubrum,占总菌株数的74.1%。<br>  从两个盐湖分离获得5株代表新分类单元的嗜盐古菌。多相分类学研究结果显示这5株嗜盐古菌分别代表5个新种,分别命名为Halomicroarculagahaiensissp.nov.(GH36T)、Natranaeroarchaeumfeicuiensesp.nov.(FCH23T)、Halalkalicoccusfeicuiensissp.nov.(FCH27T)、Natronorubrumfeicuiensesp.nov.(FCH18aT)和Natronosalvusfeicuiensisgen.sp.nov.(FCH36aT)。<br>  从HalalkalicoccusfeicuiensisFCH27T全基因组预测到FCH27_1462和FCH27_2751两条疑似硝酸盐还原酶基因,对这两条基因进行异源表达、纯化、酶活性研究,结果表明FCH27_2751的酶活较强,命名为NasHac。酶学表征结果显示,该酶最适反应温度、NaCl浓度、pH分别为70℃、2M、9.0;对NaCl浓度、温度、pH均具有广适性;Fe3+、K+、乙醇、甘油和异丙醇对该酶具有促进作用。当NaNO3为底物时,NasHac的Vmax值为30.94μg/min/mg,Km值为1.64mM。NasHac对盐浓度、pH和温度有着良好的广适性,有望应用于腌制蔬菜中硝酸盐的降解。

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