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摘要目的：<br>　　本实验通过观察香附烯酮干预在体内和体外对乳腺癌细胞蒽环类化疗药物的影响，探讨香附烯酮增加蒽环类化疗药物敏感性的作用机制，以期为临床上对蒽环类化疗药物不敏感或耐药的乳腺癌患者找寻新的治疗方法，提供一定的理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.细胞实验：CCK-8实验检测香附烯酮和阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的活力的影响。分别用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mM香附烯酮和0.078、0.156、0.313、0.625、1、25、2.5、5、10、20或40μg/mL阿霉素处理MCF-7和MCF-7/ADR细胞24h，48h或72h，检测不同时间点的细胞IC50，选取最佳的作用浓度以进行后续的实验。CCK-8实验检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的活力的影响。克隆形成实验检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的增殖的影响。流式细胞术检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡和周期的影响，Westernblots检测凋亡相关蛋白BAX、Bcl2、Cleaved-caspase3和周期相关蛋白CyclinD1和P16的表达。流式细胞术检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞内ROS表达的影响及加入ROS抑制剂NAC后，香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞内ROS表达的影响。流式细胞术检测加入ROS抑制剂NAC后，香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。Westernblots检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞内P62，NRF2，HO-1的表达。流式细胞术检测加入NRF2抑制剂Brusatol后，香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。<br>　　2.动物实验：建立MCF-7和MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤模型，当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为4组，每组各3只，腹腔注射生理盐水、阿霉素、香附烯酮或香附烯酮联合阿霉素。分时间段测取给药后裸鼠肿瘤大小及体重。生化实验检测香附烯酮对裸鼠肝肾毒性的影响。免疫组化实验检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤组织中Ki67的表达。免疫荧光实验检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤组织中ROS的表达。Westernblots检测香附烯酮联合阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤组织中P62，NRF2，HO-1的蛋白表达。<br>　　结果：<br>　　1.细胞实验<br>　　（1）香附烯酮和阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力的影响<br>　　CCK-8实验检测香附烯酮和阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的活力的结果显示，香附烯酮和阿霉素分别以浓度和时间依赖的方式抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞的活力。根据香附烯酮和阿霉素的细胞活性曲线选择浓度，其中细胞活性约等于70%的单个药物浓度用于随后的实验。因此，MCF-7细胞使用的药物浓度为ADR0.5μg/ml，CYT0.3mM，MCF-7/ADR细胞使用的药物浓度为ADR4μg/ml，CYT0.3mM。与对照组比较，单药组对MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力的影响明显高于对照组，与单药组比较，香附烯酮联合阿霉素用药组对MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力的影响明显高于单药组，差异具有统计学意义。<br>　　（2）香附烯酮联合阿霉素可抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞的增殖<br>　　在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞的增殖，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞增殖，差异具有统计学意义。<br>　　（3）香附烯酮联合阿霉素可增加MCF-7和MCF-7/ADR细胞的凋亡<br>　　在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地促进MCF-7和MCF-7/ADR细胞的凋亡，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地促进MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡。Westernblots检测凋亡相关蛋白的表达结果显示，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地促进MCF-7和MCF-7/ADR细胞中促凋亡蛋白BAX和Cleavedcaspased3的表达，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地促进MCF-7和MCF-7/ADR细胞中促凋亡蛋白BAX和Cleavedcaspased3的表达。在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地抑制了MCF-7和MCF-7/ADR细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，差异均具有统计学意义。<br>　　（4）香附烯酮联合阿霉素可增强MCF-7和MCF-7/ADR细胞G0/G1期细胞周期的抑制<br>　　在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地抑制了MCF-7和MCF-7/ADR细胞的周期G0/G1期的阻滞，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地抑制了MCF-7和MCF-7/ADR细胞的周期G0/G1期的阻滞。Westernblots用于检测细胞周期蛋白相关蛋白的表达。在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组有效地抑制了MCF-7和MCF-7/ADR细胞CyclinD1的表达，同时增加了P16的表达，与单药治疗组相比，联合用药组更有效地抑制了CyclinD1的表达，同时增加了P16的表达，差异均具有统计学意义。<br>　　（5）香附烯酮联合阿霉素增加MCF-7和MCF-7/ADR细胞中ROS产生诱导细胞凋亡<br>　　在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，单药组在DCFH-DA孵育0.5h后有效地增加了MCF-7和MCF-7/ADR细胞中ROS的表达，与单药组比较，CYT联合ADR在DCFH-DA孵育0.5h后显著增加了MCF-7和MCF-7/ADR细胞内ROS的产生。NAC（N-乙酰基-1-半胱氨酸）是一种活性氧抑制剂，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，与对照组比较，对照组在加入NAC后有效地减少了MCF-7和MCF-7/ADR细胞中ROS的表达，与联合用药组比较，联合用药组在加入NAC后显著减少了MCF-7和MCF-7/ADR细胞内ROS的产生。这些结果表明，CYT与ADR联合可诱导MCF-7和MCF-7/ADR细胞中的氧化损伤，而NAC可显著逆转CYT与ADR联合诱导的ROS生成。使用流式细胞术检测加入NAC后各组的细胞凋亡率，以进一步验证ROS与细胞凋亡之间的关系。研究结果表明，与对照组比较，在加入NAC后有效地减少了MCF-7和MCF-7/ADR的细胞凋亡，与联合用药组比较，联合用药组在加入NAC后显著减少了MCF-7和MCF-7/ADR的细胞凋亡，表明ROS的产生可能是CYT联合ADR导致细胞凋亡并增强化疗敏感性的关键作用机制之一。<br>　　（6）香附烯酮联合阿霉素通过抑制NRF2/ARE信号通路诱导MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡<br>　　Westernblots检测NRF2/ARE通路相关蛋白的表达的研究结果表明，与对照组比较，单药组P62，NRF，HO-1在MCF-7和MCF-7/ADR的细胞中表达减少，与单药组比较，联合用药组P62，NRF，HO-1在MCF-7和MCF-7/ADR的细胞表达明显减少。研究结果表明，与对照组比较，在加入Brustal后有效地增加了MCF-7和MCF-7/ADR的细胞凋亡，与CYT联合ADR比较，CYT联合ADR在加入Brustal后显著增加了MCF-7和MCF-7/ADR的细胞凋亡，表明NRF2/ARE通路可能是CYT联合ADR导致细胞凋亡并增强化疗敏感性的关键作用机制之一。<br>　　2.动物实验<br>　　（1）香附烯酮对荷瘤裸鼠肝肾功能无明显毒性<br>　　香附烯酮治疗组和对照组的肝肾毒性指数均在正常范围内，表明香附烯酮对荷瘤裸鼠无明显肝肾毒性。<br>　　（2）香附烯酮联合阿霉素对荷瘤裸鼠移植瘤有明显的抑制作用<br>　　在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的裸鼠移植瘤中，与对照组比较，单药组的肿瘤体积增长略慢于对照组；与单药组比较，联合治疗组显示肿瘤体积增长明显慢于单药组，且肿瘤体积显著减少。在所有组中，体重没有显著变化。<br>　　免疫组化显示，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的裸鼠移植瘤组织中，与对照组相比，单药组Ki67的表达较低；与单药组比较，联合用药组中Ki67的表达明显降低，差异具有统计学意义。<br>　　（3）香附烯酮联合阿霉素可能通过ROS产生对荷瘤裸鼠移植瘤显示出显著的抑制作用<br>　　使用免疫荧光检测裸鼠肿瘤组织中ROS的产生，以进一步研究香附烯酮联合阿霉素抑制裸鼠肿瘤的机制。结果表明，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的裸鼠移植瘤组织中，与对照组相比，单药组ROS的表达较高；与单药组比较，联合用药组中ROS的表达明显升高，差异具有统计学意义。<br>　　（4）香附烯酮联合阿霉素可能通过NRF2/ARE通路对荷瘤裸鼠移植瘤显示出显著的抑制作用<br>　　使用Westonblots检测裸鼠肿瘤组织中P62，NRF2，HO-1的产生，以进一步研究ADR联合CYT抑制裸鼠肿瘤的机制。结果表明，与对照组相比，单药组中P62，NRF2，HO-1的表达较低；与单药组比较，联合用药组中P62，NRF2，HO-1的表达明显降低，差异具有统计学意义。<br>　　结论：<br>　　1.研究结果初次表明，香附烯酮联合阿霉素在体内和体外都具有有效的抗MCF-7及MCF-7/ADR乳腺癌细胞增殖的作用。<br>　　2.香附烯酮在体内外都具有增加MCF-7及MCF-7/ADR乳腺癌细胞阿霉素的化疗敏感性的作用。<br>　　3.香附烯酮增加MCF-7及MCF-7/ADR乳腺癌细胞阿霉素的化疗敏感性可能是通过诱导ROS产生和抑制P62/NRF2/HO-1信号通路来实现的。