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摘要原发性肝癌是一种常见的肝脏恶性肿瘤，依据病理分为 3 种类型：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma， ICC）和肝细胞胆管混合型肝癌（HCC-ICC）。其中HCC是最常见的原发性肝癌类型，也是全球五种最常见的癌症之一。HCC 的高致死率在全球范围内所有类型的恶性肿瘤中排名第二。尽管约有80%HCC患者中被检出携带乙肝病毒或者丙肝病毒，但HCC早期发病没有显著的特征，以致早期诊断困难，即80%-90%的患者确诊后就已失去了最佳治疗时间。另外，HCC患者在治疗后还存在高复发和转移。因此，不断深入探讨HCC发生发展的分子机制，对其早期预防和治疗具有重要意义。<br>　　Nrf1和Nrf2在肝癌的发生发展的过程中，发挥了重要的调控作用。如，Nrf1在小鼠肝脏中的缺失，最终会形成肝细胞癌；而在人源肝癌细胞中Nrf1的缺失后，导致了细胞的生物学恶性行为的发生（比如：周期、凋亡、EMT相关基因的表达水平出现异常），恢复后恶性行为得到遏制，而Nrf2的缺失与其截然相反。因此， Nrf1能抑制肿瘤细胞的恶性行为，而Nrf2促进其行为。在肝癌中，Keap1经常被报道作为Nrf2的负调控因子，对于其他基因的调控较少。<br>　　本课题组在前期实验中发现，在肝癌细胞HepG2中的Keap1存在两种不同的亚型，而在MHCC97H中Keap1只表达出一条蛋白条带。因此，依据以上结果，将不同的两条蛋白条带命名为Keap1α（蛋白条带较大）和Keap1β（蛋白条带较小）。前期实验还发现，Keap1α和Keap1β在结构和功能上存在一定的异同点。为此，本文以Keap1及其亚型α和β为研究核心，进一步研究其结构和功能。通过慢病毒构建细胞系，以及依据转录组高通量测序和蛋白质互作组解析进行分析，筛选得出Keap1能够与Smad2/3相互作用，并通过一系列实验得到验证，最终得到以下主要结果：<br>　　(1) Keap1的2种亚型α和β在生物学行为上具有明显的差异。在Keap1特异敲除的细胞系（即Keap1-/-细胞系）中，细胞的迁移能力、增殖能力（包括细胞生长和克隆）和裸鼠皮下成瘤能力都被抑制，细胞的凋亡增强，细胞的周期延长。在Keap1α亚型缺失却表达Keap1β的细胞系（即Keap1β（Keap1△1-31）细胞系）中，细胞的迁移和凋亡能力增强，细胞的克隆和裸鼠皮下成瘤能力被抑制，而细胞的周期和生长速率几乎没有明显变化。在 Keap1β 亚型缺失而 Keap1α-Restore 细胞系中，细胞的迁移、增殖（生长速率和克隆能力）和裸鼠皮下成瘤能力被抑制，细胞的凋亡能力增强，细胞的周期几乎没有明显变化。对相关生物学行为的部分典型基因进行mRNA和蛋白表达水平检测，发现相关基因的表达水平出现了变化。<br>　　(2) 对Keap1的2种亚型α和β与Nrf1/2的关系进行了系统地探讨。结果显示，Keap1及其亚型α和β分布在细胞的细胞质、线粒体和细胞核中，其中主要表达于细胞质中，少量存在于线粒体上和细胞核中。Keap1不同亚型α和β对Nrf2的抑制作用主要发生在细胞质中，其中，Keap1α 亚型的抑制作用强于 Keap1β 亚型；但是，Keap1与Nrf1之间的是否存在调控关系，或者是通过典型的Keap1-Nrf2信号通路影响Nrf1的表达，需要更进一步进行详细的机制研究。<br>　　(3) 通过转录组高通量测序数据，进行GO/KEGG功能富集分析，同时，结合蛋白质互作组数据，发现了2种亚型调控的基因具有差异性，也揭示Keap1可能与Smad2/3存在相互作用。并通过一系列实验进行了验证，结果显示Keap1及其亚型α和β与Smad2/3主要在细胞质中相互作用。他们之间存在功能如下：Keap1缺失会导致Smad2/3及其下游基因mRNA和蛋白水平明显降低，而Keap1α或者Keap1β缺失，促进了Smad2/3及其下游基因mRNA和蛋白水平的表达；在Nrf1缺失（即Nrf1-/-细胞系）条件下，细胞中Smad2/3/4、TGF-β1和E2F4的mRNA和蛋白明显降低；相反在Nrf2缺失（即Nrf2-/-细胞系）条件下，细胞中Smad2/3/4、TGF-β1和E2F4的mRNA和蛋白明显升高。<br>　　总而言之，本文以Keap1及其亚型α和β为研究核心，探索了差异影响肝癌发展的生物学行为。依据转录组高通量测序和蛋白质互作组数据，筛选出特异调控基因和富集的通路，并揭示了Keap1及其亚型α和β调控的基因和通路，为深入探讨它们在肝癌中的作用机制及开发防治靶点提供了新思路。