摘要目的:肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是各种肝脏手术的主要病理过程之一,可以通过启动炎症级联反应等一系列分子事件,造成患者肝功能衰竭等严重后果。然而,由于肝脏缺血再灌注损伤的内在机制尚不明确,目前仍缺乏有效的防治策略。所以寻找缓解肝脏I/R损伤的治疗策略是每一位肝脏相关医务工作者的重要任务。肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAF)6是实体器官固有免疫的关键E3泛素连接酶,通过介导非降解的K63泛素链传导外部应激信号,从而激活IκB激酶(IκB kinase,IKK)复合体驱动过度活跃的炎症级联反应,参与肝脏I/R损伤的进展。三结构域蛋白37(tripartite motif containing37,TRIM37)是蛋白质TRIM超家族的成员,最近有报道称其参与多种炎症免疫反应。本研究的目的是通过阐明TRIM37通过增强IKK复合体诱导的炎症级联反应而加重肝脏I/R损伤的作用机制,为缓解肝脏I/R损伤提供潜在的治疗策略,并提供基础实验依据。<br> 方法:1.采用C57BL/6J小鼠建立肝脏I/R损伤模型,并提取C57BL/6J小鼠原代Kupffer细胞,在体外建立细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型。利用Western blot(WB)检测TRIM37、TRAF6、IKK、p-IKK、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、白细胞介素6(interleukin6,IL-6)和β-actin在小鼠肝脏I/R损伤中的蛋白表达情况;<br> 2.采用腺病毒载体在体内和体外干扰TRIM37,使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、IL-6和白细胞介素1β(interleukin1β,IL-1β)在小鼠血清和细胞上清液中的释放水平;使用qRT-PCR检测单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein1,MCP-1)、CXC趋化因子配体10(C-X-C chemokine ligand10,CXCL-10)和CXC趋化因子配体2(C-X-C chemokine ligand2,CXCL-2)的mRNA水平;使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中TRAF6与IKK的表达水平和p65的入核情况;使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠肝脏病理改变(依据经典的Suzuki评分标准);使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧鸟苷三磷酸缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)法评估肝脏细胞凋亡;使用肝酶检测试剂盒评估天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)在小鼠血清中的释放情况;使用WB检测TRIM37、TRAF6、IKK、p-IKK、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、TGF-β激活激酶1(TGF-beta activated kinase1,TAK1)、p-TAK1、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)α、p-IκBα、p65、p-p65、IL-6和β-actin的蛋白表达情况;<br> 3.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37,再利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰TRAF2、TRAF4、TRAF6的表达,利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、TAK1、p-TAK1、白介素-1受体相关激酶1(interleukin1receptor associated kinase1,IRAK1)、p-IRAK1、Ubiquitin(linkage-specific K63)和β-actin的蛋白表达情况;使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平;使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平;免疫沉淀检测TRIM37和TRAF6直接相互作用情况;使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中p-IKKβ的活化情况;<br> 4.先在体内采用腺病毒载体过表达TRIM37,再利用siRNA干扰TRAF6的表达,利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、TAK1、p-TAK1、IRAK1、p-IRAK1、B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(B-lymphomatoma-2gene-related promoter,BAD)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL2)、BCL2相关X(BCL2associated X BAX)、有丝分裂非受体型酪氨酸激酶相关蛋白(SRC associated in mitosis of68kD,Sam68)、IL-6、IL-1β和β-actin的蛋白表达情况;使用肝酶检测试剂盒评估AST和ALT在小鼠血清中的释放情况;使用HE染色观察小鼠肝脏病理改变;使用TUNEL法评估肝脏细胞凋亡;使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平;使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平;使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中p-IKK和p-p65的活化情况;<br> 5.先在体内采用腺病毒载体过表达TRIM37,再使用TRAF6-Ubc13相互作用的特异性抑制剂C25-140阻断TRAF6和Ubc13的相互作用,使用HE染色观察小鼠肝脏病理改变;使用TUNEL法评估肝脏细胞凋亡;使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平;使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平;使用WB检测BAD、BCL2、BAX、caspase3、c-caspase3、caspase7、c-caspase7和β-actin的蛋白表达情况;<br> 6.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37,再分别使用C25-140和si-TRAF6,使用ExKine细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞质蛋白和核蛋白,利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、IKKγ、p-IKKγ和β-actin的蛋白表达情况;使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中IKKγ的活化情况;<br> 7.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37,再分别使用C25-140和si-TRAF6,设置1小时、12小时、24小时、36小时复氧梯度,使用ELISA检测IL-6的释放水平;使用qRT-PCR检测CXCL-10的mRNA水平;<br> 8.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37,再分别使用C25-140、si-TRAF6和IKKβ的特异性抑制剂IMD0354,设置1小时、18小时、24小时、36小时复氧梯度,利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65和β-actin的蛋白表达情况;使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中IKKγ的活化情况。<br> 结果:1.TRIM37和TRAF6的蛋白表达在体外H/R模型中显著上调,同时在体内I/R模型中检测到IKK的过度激活;<br> 2.在体内模型中干扰TRIM37可以抑制IKK的过度激活,同时显著缓解小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、炎症因子及ALT、AST的释放;在体外模型中同样发现干扰TRIM37可以缓解H/R引起的IKK/NF-κB通路的激活、细胞炎症因子的释放;<br> 3.在体内模型中过表达TRIM37可以显著激活IKK/NF-κB通路,加重小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、血清炎症因子的释放;<br> 4.在体外模型中使用si-TRAF6显著逆转了H/R后TRIM37过度表达导致的IKK/NF-κB通路的过度激活,而si-TRAF2、si-TRAF4则不能;通过免疫沉淀发现TRIM37和TRAF6在肝固有免疫细胞Kupffer细胞中存在直接相互作用,这种相互作用与K63泛素化修饰相关。同时si-TRAF6可以显著逆转过表达TRIM37对H/R后IKK及其上游炎症信号的影响;<br> 5.在体内模型中使用si-TRAF6显著逆转了过表达TRIM37对I/R后IKK/NF-κB通路的影响,同时显著缓解小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、血清炎症因子及ALT、AST的释放;<br> 6.在体内模型中使用TRAF6-Ubc13相互作用的特异性抑制剂C25-140部分缓解了过表达TRIM37对I/R小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡和血清炎症因子释放的影响。<br> 结论:1.TRIM37在小鼠肝I/R模型和细胞H/R模型中显著上调,并在其中发挥加重肝I/R损伤的作用;<br> 2.TRIM37通过与TRAF6直接相互作用并引起K63泛素化修饰的方式加重肝I/R损伤;<br> 3.TRIM37以TRAF6依赖的方式促进IKKγ易位从而延长肝I/R损伤的持续时间。
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