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摘要目的：肝脏缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是各种肝脏手术的主要病理过程之一，可以通过启动炎症级联反应等一系列分子事件，造成患者肝功能衰竭等严重后果。然而，由于肝脏缺血再灌注损伤的内在机制尚不明确，目前仍缺乏有效的防治策略。所以寻找缓解肝脏I/R损伤的治疗策略是每一位肝脏相关医务工作者的重要任务。肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）6是实体器官固有免疫的关键E3泛素连接酶，通过介导非降解的K63泛素链传导外部应激信号，从而激活IκB激酶（IκB kinase，IKK）复合体驱动过度活跃的炎症级联反应，参与肝脏I/R损伤的进展。三结构域蛋白37（tripartite motif containing37，TRIM37）是蛋白质TRIM超家族的成员，最近有报道称其参与多种炎症免疫反应。本研究的目的是通过阐明TRIM37通过增强IKK复合体诱导的炎症级联反应而加重肝脏I/R损伤的作用机制，为缓解肝脏I/R损伤提供潜在的治疗策略，并提供基础实验依据。<br>　　方法：1.采用C57BL/6J小鼠建立肝脏I/R损伤模型，并提取C57BL/6J小鼠原代Kupffer细胞，在体外建立细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型。利用Western blot（WB）检测TRIM37、TRAF6、IKK、p-IKK、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、白细胞介素6（interleukin6，IL-6）和β-actin在小鼠肝脏I/R损伤中的蛋白表达情况；<br>　　2.采用腺病毒载体在体内和体外干扰TRIM37，使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测炎症因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6和白细胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）在小鼠血清和细胞上清液中的释放水平；使用qRT-PCR检测单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）、CXC趋化因子配体10（C-X-C chemokine ligand10，CXCL-10）和CXC趋化因子配体2（C-X-C chemokine ligand2，CXCL-2）的mRNA水平；使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中TRAF6与IKK的表达水平和p65的入核情况；使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察小鼠肝脏病理改变（依据经典的Suzuki评分标准）；使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧鸟苷三磷酸缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling，TUNEL）法评估肝脏细胞凋亡；使用肝酶检测试剂盒评估天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）在小鼠血清中的释放情况；使用WB检测TRIM37、TRAF6、IKK、p-IKK、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、TGF-β激活激酶1（TGF-beta activated kinase1，TAK1）、p-TAK1、核因子κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）α、p-IκBα、p65、p-p65、IL-6和β-actin的蛋白表达情况；<br>　　3.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37，再利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰TRAF2、TRAF4、TRAF6的表达，利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、TAK1、p-TAK1、白介素-1受体相关激酶1（interleukin1receptor associated kinase1，IRAK1）、p-IRAK1、Ubiquitin（linkage-specific K63）和β-actin的蛋白表达情况；使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平；使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平；免疫沉淀检测TRIM37和TRAF6直接相互作用情况；使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中p-IKKβ的活化情况；<br>　　4.先在体内采用腺病毒载体过表达TRIM37，再利用siRNA干扰TRAF6的表达，利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、TAK1、p-TAK1、IRAK1、p-IRAK1、B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子（B-lymphomatoma-2gene-related promoter，BAD）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）、BCL2相关X（BCL2associated X BAX）、有丝分裂非受体型酪氨酸激酶相关蛋白（SRC associated in mitosis of68kD，Sam68）、IL-6、IL-1β和β-actin的蛋白表达情况；使用肝酶检测试剂盒评估AST和ALT在小鼠血清中的释放情况；使用HE染色观察小鼠肝脏病理改变；使用TUNEL法评估肝脏细胞凋亡；使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平；使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平；使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中p-IKK和p-p65的活化情况；<br>　　5.先在体内采用腺病毒载体过表达TRIM37，再使用TRAF6-Ubc13相互作用的特异性抑制剂C25-140阻断TRAF6和Ubc13的相互作用，使用HE染色观察小鼠肝脏病理改变；使用TUNEL法评估肝脏细胞凋亡；使用ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β的释放水平；使用qRT-PCR检测MCP-1、CXCL-10和CXCL-2的mRNA水平；使用WB检测BAD、BCL2、BAX、caspase3、c-caspase3、caspase7、c-caspase7和β-actin的蛋白表达情况；<br>　　6.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37，再分别使用C25-140和si-TRAF6，使用ExKine细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞质蛋白和核蛋白，利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、IKKγ、p-IKKγ和β-actin的蛋白表达情况；使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中IKKγ的活化情况；<br>　　7.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37，再分别使用C25-140和si-TRAF6，设置1小时、12小时、24小时、36小时复氧梯度，使用ELISA检测IL-6的释放水平；使用qRT-PCR检测CXCL-10的mRNA水平；<br>　　8.先在体外采用腺病毒载体过表达TRIM37，再分别使用C25-140、si-TRAF6和IKKβ的特异性抑制剂IMD0354，设置1小时、18小时、24小时、36小时复氧梯度，利用WB检测IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65和β-actin的蛋白表达情况；使用免疫荧光检测原代Kupffer细胞中IKKγ的活化情况。<br>　　结果：1.TRIM37和TRAF6的蛋白表达在体外H/R模型中显著上调，同时在体内I/R模型中检测到IKK的过度激活；<br>　　2.在体内模型中干扰TRIM37可以抑制IKK的过度激活，同时显著缓解小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、炎症因子及ALT、AST的释放；在体外模型中同样发现干扰TRIM37可以缓解H/R引起的IKK/NF-κB通路的激活、细胞炎症因子的释放；<br>　　3.在体内模型中过表达TRIM37可以显著激活IKK/NF-κB通路，加重小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、血清炎症因子的释放；<br>　　4.在体外模型中使用si-TRAF6显著逆转了H/R后TRIM37过度表达导致的IKK/NF-κB通路的过度激活，而si-TRAF2、si-TRAF4则不能；通过免疫沉淀发现TRIM37和TRAF6在肝固有免疫细胞Kupffer细胞中存在直接相互作用，这种相互作用与K63泛素化修饰相关。同时si-TRAF6可以显著逆转过表达TRIM37对H/R后IKK及其上游炎症信号的影响；<br>　　5.在体内模型中使用si-TRAF6显著逆转了过表达TRIM37对I/R后IKK/NF-κB通路的影响，同时显著缓解小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、血清炎症因子及ALT、AST的释放；<br>　　6.在体内模型中使用TRAF6-Ubc13相互作用的特异性抑制剂C25-140部分缓解了过表达TRIM37对I/R小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡和血清炎症因子释放的影响。<br>　　结论：1．TRIM37在小鼠肝I/R模型和细胞H/R模型中显著上调，并在其中发挥加重肝I/R损伤的作用；<br>　　2．TRIM37通过与TRAF6直接相互作用并引起K63泛素化修饰的方式加重肝I/R损伤；<br>　　3．TRIM37以TRAF6依赖的方式促进IKKγ易位从而延长肝I/R损伤的持续时间。