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摘要目的：糖尿病肾病(Diabetic kidney disease，DKD)是终末期肾病(End-stage kidney Disease，ESRD)和慢性肾病的常见原因，严重影响人类健康。肾小球系膜细胞(Mesangial cells，MCs)是一类反应活跃的肾脏固有细胞，占肾小球细胞总数的30~40%，且肾小球系膜异常增生是DKD早期的主要病理特征之一。深入探讨DKD状态下的肾小球系膜细胞的病理机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点将会给临床诊断和防治DKD带来重大意义。因此，我们探索了DKD MCs的特定分子生物学行为，并通过单细胞核RNA测序(Single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）解释了DKD状态下MCs异常增殖的新机制。通过snRNA-seq发现：lncMCS在MCs中特异性高表达且在DKD中表达上调。本研究的目的是验证lncMCS在高糖状态下的系膜细胞中特异性高表达以及探索其生物学功能的调控作用，并阐明lncMCS是通过何种机制参与DKD的发生发展，为DKD的诊断或者治疗靶点提供科学依据。<br>　　方法：首先通过snRNA-seq技术分析并筛选出4个候选lncRNAs，是MCs中特异性lncRNA且与DKD密切相关。接着通过qRT-PCR在肾脏固有细胞MCs、足细胞和肾小管上皮细胞和高低糖培养的MCs中检测发现E130307A14Rik在MCs中特异表达且在H-MC中表达差异最显著；因此我们将E130307A14Rik命名为lncMCS（系膜细胞特异性lncRNA）并选择lncMCS作为本课题的研究对象。紧接着，通过核质分离qRT-PCR 和FISH 方法检测 lncMCS在MCs的核质分布。第二，为了探讨lncMCS在DKD中的临床价值，通过qRT-PCR检测lncMCS在DKD小鼠肾脏组织中以及lncMCS的人源类似物在DKD患者血浆中的表达水平，并通过皮尔逊相关系数分析lncMCS与DKD相关肾功能指标的相关性。第三，为了探索lncMCS在DKD MCs中的生物学功能，我们构建了pcDNA3.1(+)-lncMCS过表达质粒和设计合成了 lncMCS的3条 siRNAs并通过CCK-8, EdU，流式细胞周期检测技术以及western blot检测lncMCS对MCs增殖活性的调控作用；通过qRT-PCR, western blot和IF检测lncMCS对MCs炎症和纤维化的调控作用。第四，为了探讨lncMCS的生成机制，通过qRT-PCR,ChIP和双荧光素酶实验验证转录因子NF-κB p65是否可以和lncMCS的启动子区域相结合并调控lncMCS的表达水平。第五，为了探究lncMCS调控MCs增殖、炎症和纤维化的具体机制，通过RNA-pull down和RIP发现lncMCS与高迁移率族蛋白B1（High-mobility group box 1， Hmgb1）相互结合。第六，为了探讨lncMCS促进Hmgb1核质易位，通过核质分离western blot和FISH-IF来检测Hmgb1在MCs中细胞质和细胞核的表达水平以及分布情况是否由lncMCS所调控。第七，为了明确lncMCS如何通过调控Hmgb1而激活NF-κB信号通路，通过CoIP和western blot实验, 检测Hmgb1与IκBα相互结合和NF-κB信号通路的关键分子蛋白表达情况。最后，我们构建敲低lncMCS的慢病毒并通过尾静脉向DKD db/db小鼠注射，并通过小鼠以及脏器活体成像，qRT-PCR和FISH确认敲低lncMCS的慢病毒成功感染肾脏并敲低体内肾脏组织中lncMCS的表达水平。然后通过qRT-PCR， western blot和组织免疫荧光等实验探讨lncMCS/Hmgb1/NF-κB轴在DKD小鼠体内对肾脏组织的增殖、炎症和纤维化。<br>　　结果：第一，由snRNA-seq检测发现LncMCS是系膜细胞特异性表达分子且在DKD系膜细胞集群中表达上调。随后通过qRT-PCR在肾脏固有细胞系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞和L-MC或H-MC中检测，发现lncMCS(E130307A14Rik）在MCs中特异高表达，且在H-MC中表达差异倍数最显著。第二，lncMCS在MCs的细胞质和细胞核中均有表达但主要分布在细胞质中。第三，lncMCS在DKD中表达上调，且与DKD相关肾功能指标呈正相关。第四，过表达的lncMCS促进MCs增殖,炎症和纤维化，反之亦然。第五，ChIP和双荧光素酶实验结果表明，转录因子NF-κB p65可以和lncMCS的启动子区域结合；且过表达p65可以上调lncMCS在MCs的表达，相反敲低p65可以下调lncMCS的表达。第六，RNA-pull down和RIP实验结果表明lncMCS和Hmgb1相互结合：lncMCS的1-1500nt 片段与Hmgb1特异性结合；Hmgb1的A box结构域可以富集到lncMCS。第七，通过核质分离western blot和FISH-IF实验结果发现，过表达的lncMCS可以促进低糖状态下的MCs中的Hmgb1核质易位使其分布在细胞质增多，和lncMCS相结合；反之亦然。第八，通过CoIP和western blot实验结果发现，Hmgb1可以特异性结合IκBα，从而激活NF-κB信号通路。通过挽救实验，我们发现lncMCS通过与Hmgb1相互作用激活NF-κB信号通路从而加重DKD MCs的增殖，炎症和纤维化而加重DKD进展。最后，构建敲低lncMCS的慢病毒并通过尾静脉向DKD db/db小鼠注射，小鼠以及脏器活体成像，qRT-PCR和FISH确认敲低lncMCS的慢病毒成功感染肾脏并成功敲低体内肾脏组织中lncMCS的表达水平。DKD相关的肾功能指标（血糖、尿白蛋白、尿肌酐和尿肌酐/尿白蛋白）提示敲低lncMCS后可以缓解DKD小鼠病情。通过qRT-PCR, western blot和组织免疫荧光等实验表明敲低lncMCS后可以缓解DKD小鼠肾脏增殖，炎症和纤维化。<br>　　结论：综上所述，我们通过 snRNA-seq 发现 lncMCS （E130307A14Rik）在MCs中特异性高表达，且lncMCS在DKD中表达上调，与DKD相关的肾功能指标呈正相关。NF-κB p65促进了高糖诱导的MCs中的lncMCS异常高表达。同时，LncMCS与Hmgb1结合促进Hmgb1核质易位，使得Hmgb1在细胞质中分布增多，并促进IκBα磷酸化，NF-κB被释放并活化后进入细胞核中激活NF-κB信号通路。最终，lncMCS通过Hmgb1/NF-κB信号通路促进MCs的增殖，炎症和纤维化，导致DKD进展的恶化。我们的研究结果有助于进一步了解lncMCS的功能和分子机制，lncMCS有可能作为DKD的治疗靶点和生物标志物。