检索历史 清除

摘要肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在男性和女性中分别占第一位和第二位，而致死率均高居肿瘤第一位。迄今为止，虽然通过手术、放疗化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种方式治疗肺癌，但疗效有限。因此，积极探索开发肿瘤治疗新策略，对提高肺癌患者的生存率和改善患者的生存质量具有重大的理论和现实意义。<br>　　细胞衰老是由应激损伤或某些生理改变而触发的一种细胞反应，其特征是长时间的、不可逆的细胞周期停滞，具有细胞炎性因子分泌、大分子损伤和代谢改变等特性。发生衰老的细胞即使在最佳生长环境和最有效有丝分裂源刺激下，细胞仍然无法摆脱增殖停滞的一种永久化状态。而癌细胞是一种借助各种机制摆脱Hayflick限制的具有无限增殖能力的细胞。已有研究表明，细胞衰老在肿瘤发生发展进程中具有抑癌与促癌双重作用。恶性肿瘤发生初期DNA损伤等诱导的细胞衰老抑制细胞增殖从而阻止细胞恶性转化，但肿瘤发生后期衰老细胞释放的衰老相关分泌因子（SASP）诱导的炎症反应具有促肿瘤发生作用。虽然现在很多研究都已阐述衰老和肿瘤的关系及作用机制，但细胞衰老具体如何与肿瘤细胞互动仍有待进一步探索。MINK1是哺乳动物STE20/MAP4K家族成员之一，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。MINK1最初作为促炎症反应的一个重要激酶,并调节多种细胞进程,包括细胞形态、细胞骨架重排和细胞存活。在本研究中，我们发现MINK1调节肺癌细胞核纤层稳定并控制细胞衰老。<br>　　目的：<br>　　探讨MINK1(Misshapen-like kinase1)表达在调控肺癌细胞核纤层稳定及细胞衰老中的作用及潜在分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.使用在线数据库及组织芯片分析MINK1在肺癌组织样本中的表达水平及与生存预后的关系。<br>　　2.基于plkO.1-shRNA敲减载体构建稳定敲减MINK1表达A549细胞，通过qRT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白质表达水平检测敲减效率，并通过光学显微镜观察细胞形态变化情况。<br>　　3.CCK8、平板克隆及流式细胞实验检测稳定敲减MINK1表达细胞增殖变化情况。<br>　　4.通过β-半乳糖苷酶染色检测MINK1对细胞衰老的影响。qRT-PCR检测细胞衰老分泌相关因子的表达水平。<br>　　5.Western blot和免疫荧光检测核纤层组分Lamin A/C、Lamin B1、异染色质标记物H3K9me3及常染色质标记物H3K4me2蛋白质表达与亚细胞定位变化情况。<br>　　6.透射电镜观察稳定敲减MINK1表达细胞核间隙结构变化情况。<br>　　7.低剂量顺铂处理A549构建细胞衰老模型，并通过β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、Western blot和平板克隆实验检测细胞衰老、DNA损伤变化及增殖抑制情况。<br>　　8.稳定敲减MINK1表达A549细胞联合低剂量顺铂处理后，通过β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、Western blot、平板克隆检测检测细胞衰老及增殖抑制情况。<br>　　9.构建稳定表达MINK1-3Flag表达A549细胞，免疫共沉淀银染切胶后联合质谱技术鉴定MINK1潜在互作蛋白。<br>　　结果：<br>　　1.在线数据分析显示MINK1在肺腺癌中mRNA表达水平显著高于癌旁组织。肺腺癌组织微阵列分析发现MINK1在肺癌组织的表达量明显高于癌旁组织（Plt;0.001），生存分析证明MINK1表达水平与患者生存时间和生存率均显著负相关（Plt;0.05）。<br>　　2.基于plkO.1-shRNA表达载体成功构建稳定敲减MINK1表达肺腺癌A549细胞，与对照组相比，稳定敲减组中MINK1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（Plt;0.05）。稳定敲减MINK1表达后导致细胞体积变大且部分细胞形态不规则。<br>　　3.利用稳定敲减MINK1表达细胞进行平板克隆和CCK8实验，结果显示与对照组相比，敲减MINK1导致细胞增殖速率减慢。流式细胞检测结果显示与对照相比，敲减MINK1表达对细胞周期无显著影响，且细胞凋亡速率变化不明显。<br>　　4.β-半乳糖苷酶（β-gal）检测结果显示肺癌细胞中稳定敲减MINK1表达后深蓝衰老细胞数量增加。且qRT-PCR检测结果显示，于对照组细胞相比，衰老相关辅助分泌因子：IL-6、TNF、CCL2、MMP9等在定敲减MINK1表达细胞中显著上升。<br>　　5.免疫荧光检测证明稳定敲减MINK1表达后Lamin A/C和Lamin B1在细胞核膜周信号强度显著下降，且导致核膜出芽和微核。异染色质标记物H3K9me3由典型颗粒装转变为核内弥散型分布，常染色质标记物H3K4me2表达水平无显著变化。<br>　　6.透射电镜检测结果证明稳定敲减MINK1表达后细胞核形态/结构异常；对照组细胞中核间隙均匀程度高，异染色质在核内膜上正常分布；而稳定敲减MINK1导致核间隙紊乱，且核膜周围异染色质丢失。<br>　　7.利用化疗药物顺铂（DDP）建立低剂量衰老诱导模型。β-半乳糖苷酶染色结果显示，低剂量（2μM）顺铂处理6天，可诱导肺癌细胞衰老，而较高剂量顺铂诱导细胞凋亡。平板克隆实验证明低剂量顺铂（2μM）处理6天，可以抑制肺癌细胞增殖。免疫荧光发现随着顺铂浓度增加，肺癌细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX表达上升。证明低浓度顺铂在肺癌细胞中具有很强的衰老诱导、细胞增殖抑制、DNA损伤诱导作用。<br>　　8.利用稳定敲减MINK1表达肺癌细胞联合低剂量顺铂处理，β-半乳糖苷酶染色和平板克隆实验结果显示与对照组相比，联合低浓度化疗药物顺铂能引发更强烈的细胞衰老、细胞增殖减缓。qRT-PCR实验结果说明，稳定敲减MINK1表达细胞联合低剂量顺铂处理能引起衰老相关细胞分泌因子IL-6、TNF、CCL2、MMP9的分泌，促进细胞衰老。除此，免疫荧光和Western bolt实验证明稳定敲减MINK1表达肺癌细胞联合低剂量顺铂处理诱导更强的DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白表达。<br>　　9.为阐明肺癌细胞中MINK1调节核纤层稳定而控制细胞衰老的具体分子机制，通过质谱鉴定MINK1潜在互作蛋白，其中肽段数排前10的蛋白中包含TGF-β、PS1TP5BP1、PIP、PLEC等蛋白。为后续MINK1如何调控核纤层影响细胞衰老的分子机制进行探索。<br>　　结论：<br>　　通过在线数据库分析和组织芯片分析发现MINK1在肺癌中的mRNA和蛋白水平表达显著增高。基于建立稳定敲减MINK1肺癌细胞中发现细胞增殖减缓且不依赖细胞凋亡和坏死，但诱导细胞衰老。进一步研究发现稳定敲减MINK1后造成核纤层结构失调，核间隙紊乱，核膜外周异染色质减少，衰老细胞增多。后续研究发现定敲减MINK1细胞联合低剂量化疗药物顺铂可以增强其杀伤作用和加剧细胞衰老比例。最后通过质谱分析鉴定肺癌细胞中MINK1的互作蛋白，包含TGF-β、PS1TP5BP1、PIP、PLEC等。